实时荧光定量实时荧光定量PCPCRR主讲人：廖旭东主讲人：廖旭东PCRPCR定义定义PCRPCR简称聚合酶链式反应。聚合酶链式简称聚合酶链式反应。聚合酶链式反应，是指在体外，酶促合成特异性反应，是指在体外，酶促合成特异性DNADNA片段的一种方法片段的一种方法,,由高温变性、低温退火和由高温变性、低温退火和适温延伸等几步反应组成一个周期适温延伸等几步反应组成一个周期,,循环进循环进行行,,使目的使目的DNADNA得以迅速扩增得以迅速扩增,,具有特异具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时的特点。性强、灵敏度高、操作简便、省时的特点。DNADNA聚合酶以单链聚合酶以单链DNADNA为模板，通过一为模板，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNADNA模板中的一段互补序列结合，形成部模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。分双链。PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR反应条件为温度、时间和循环次数。反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的温度与时间的设置设置：基于：基于PCRPCR原理三步骤原理三步骤而设置变性而设置变性--退火退火--延伸三个温度点。在标延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链准反应中采用三温度点法，双链DNADNA在在9900～～95℃95℃变性，再迅速冷却至变性，再迅速冷却至4040～～60℃60℃，，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至温至7070～～75℃75℃，在，在TaqDNATaqDNA聚合酶的作聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因可采用二温度点法，除变对于较短靶基因可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用一般采用94℃94℃变性，变性，65℃65℃左右退火与延左右退火与延伸伸((此温度此温度TaqDNATaqDNA酶仍有较高的催化活酶仍有较高的催化活性性))。。温度与时间的具体分析温度与时间的具体分析①①变性温度与时间：变性温度低，解链不变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致完全是导致PCRPCR失败的最主要原因。一般失败的最主要原因。一般情况下，情况下，93℃93℃～～94lmin℃94lmin℃足以使模板足以使模板DNADNA变性，若低于变性，若低于93℃93℃则需延长时间，则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCRPCR产物完全变性，就会导致产物完全变性，就会导致PCRPCR失败。失败。温度与时间的具体分析温度与时间的具体分析②②退火退火((复性复性))温度与时间：退火温度是影响温度与时间：退火温度是影响PCPCRR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃40℃～～60℃60℃，可使引物和模板发生结合。由于，可使引物和模板发生结合。由于模板模板DNADNA比引物复杂得多，引物和模板之间的比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度。及其浓度，还有靶基因序列的长度。温度与时间的具体分析温度与时间的具体分析对于对于2020个核苷酸，个核苷酸，55℃55℃为选择最适退火温度的为选择最适退火温度的起点较为理想。起点较为理想。复性温度复性温度==解链温度解链温度-(5-(5～～10)℃10)℃在解链温度允许范围内，选择较高的复性温度可在解链温度允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCRPCR反应的特异性。复性时间一般为反应的特异性。复性时间一般为3030～～60sec60sec，足以使引物与模板之间完全结合。，足以使引物与模板之间完全结合。温度与时间的具体分析温度与时间的具体分析③③延伸温度与时间：延伸温度与时间：TaqDNATaqDNA聚合酶的生物学聚合酶的生物学活性...
