CTLL-2细胞的复苏及培养条件的探讨�袁铿袁芳李洁(江西省医学科学研究所肿瘤研究室南昌330006)【提要】目的:探讨CTLL-2细胞(细胞毒性T淋巴细胞株)的复苏及培养的最佳条件,解决实验室CTLL-2细胞经液氮冻存后复苏难的问题。方法:将从液氮取出复苏后的CTLL-2细胞分为两组,在实验组培养体系中加大IL-2的剂量,使终浓度为1000U/ml;对照组培养体系中IL-2剂量终浓度为300U/ml,培养观察。结果:实验组与对照组比较实验组CTLL-2细胞静止期缩短,细胞折光率强,有增殖现象,细胞形态明显优于对照组。实验组复苏一周后进入正常细胞周期,而对照组细胞数量减少,细胞萎缩最终死亡。值得一提的是实验组进入正常细胞周期后逐渐递减培养体系中的IL-2含量,最后维持在一个恒定的剂量上,CTLL-2细胞仍然稳定增殖传代,这时的CTLL-2细胞可以用来检测IL-2的反应性,这种培养方法的建立解决了实验室CTLL-2细胞复苏难的问题。关键词:细胞毒性T淋巴细胞复苏细胞��细胞培养白细胞介素2中图号:R392-33CTLL-2细胞来自白血病细胞免疫的C57BL/6小鼠的脾细胞,属于细胞毒性T细胞亚群,是白细胞介素2(IL-2)依赖性细胞株。它对人IL-2的反应性良好,因此在研究IL-2的体内代谢动力学、IL-2与其他细胞因子的相互关系和其在多种疾病发生中的作用以及IL-2的制备纯化等利用CTLL-2细胞测定IL-2活性具有简便、敏感、稳定、特异等优点,但也存在某些问题:如CTLL-2细胞经液氮冻存后复苏较难,因为CTLL-2细胞在复苏培养后有一较长的静止期,表现为细胞活性降低,细胞增殖停滞,这是CTLL-2细胞最难度过的一关,往往导致复苏失败。为此,我们对CTLL-2细胞的复苏及培养条件进行了探讨,在实验中取得较满意的结果。1材料与方法1.1CTLL-2细胞的复苏将冻存于液氮的CTLL-2细胞取出,迅速置42℃水浴中融解,在无菌条件下将冻存管中的细胞移至试管内,缓慢滴加37℃含20%FCS的RPMI1640培养液,并轻轻摇匀,加至原体积的3倍,置离心机1000rpm/min,离心5min,弃上清,计数培养。1.2CTLL-2的培养及增殖动力学复苏后细胞用0.4%台盼蓝染色存活率在90%以上。用含20%FCS、20mmol/LHepes、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的RPMI1640调细胞浓度为5×105/ml,然后分成两组。第一组在上述培养体系中加1000U/mlIL-2(卫生部长春生物制品所产);第二组在培养体系中加300U/mlIL-2,分别置37℃5%CO2孵箱中培养。24h后倒置显微镜下见:细胞折光率差,胞浆中颗粒增21江西医学院学报1999;39(4):21～23ActaAcademiaeMedicinaeJiangxi���补充词江西省卫生厅资助课题多,有些细胞萎缩,将培养瓶直立片刻,使细胞下沉,吸弃上相2/3原液,按原培养体系两组分别换液一次。3d后第一组细胞形态增大,细胞立体感增强,细胞活力逐渐恢复,开始有增殖出现,以后3d换液一次,一周后细胞恢复正常活力,隔2d可传代一次。此时每次换液递减IL-2的含量,直至最后维持在300U/ml仍然稳定增殖传代,培养体系中IL-2含量低于300U/ml则细胞开始衰亡。第二组细胞3d后见活性明显变差,细胞大多萎缩,第三天后基本全部死亡。2结果与讨论1)复苏后的细胞存活率在90%以上,24h后细胞活性下降,出现细胞胞浆萎缩,折光性差、圆形颗粒增多等。说明CTLL-2细胞对IL-2的依赖性很强。如果IL-2剂量一旦达不到所需要的浓度,或者CTLL-2细胞复苏后的功能尚未恢复,摄取IL-2有困难,细胞则出现上述情况直至死亡。2)我们在培养体系中加大IL-2的量,可缩短CTLL-2细胞的静止期,使细胞迅速恢复活力,稳定增殖。3)值得一提的是用大剂量IL-2培养的CTLL-2细胞在恢复正常生长周期后应逐渐递减其IL-2用量。当用作检测时以300U/ml为基线,加入待测样本,再递减每毫升IL-2的含量,便可对待测物所含IL-2作定性及初步定量。4)上述培养方法的建立,解决了CTLL-2细胞培养难的问题,为实验室样品中IL-2的定性及初步定量提供了方便。3参考文献1王长安.天然细胞毒测定-LDH释放法.中国免疫学杂志,1988,4(1):442曹雪涛.白细胞介素2的基础与临床.北京:科学出版社,1990.473周正任,姚振宇,杨晓临,等.口服小双歧杆菌活菌制剂对机体免疫功能的增强效应.微生物学杂志,1998,18(4):5(收稿日期1999—11—18)AnApproachintotheConditionforResuscitationandCultivationofCTLL-2CellsYuanKengYua...
