硫氧还蛋白辣椒Gateway技术Trh9基因分析研究 生物技术专业VIP专享VIP免费

摘要：硫氧还蛋白(Thioredoxin，Trx)是重要的酶活力调节蛋白，在植物、动物、细菌中均有发现，它是仅有12kd的一类酸性蛋白，在多种反应中起到重要作用，如氧化还原载体的功能。本研究克隆了硫氧还蛋白基因Trh9，用Gateway技术构建Trh9基因及其过表达载体35S:Cath9，农杆菌转化后注射辣椒叶片，采用组织染色的测定的方法检测细胞死亡情况，结果显示Trh9在辣椒叶片的过表达能够引起细胞死亡，暗示该基因可能与辣椒的抗病有关。关键词：硫氧还蛋白辣椒Gateway技术Trh9基因1引言辣椒(CapsicumfrutescensL．)为茄科植物，也被称之为番椒、牛角椒、长辣椒、菜椒等，未成熟时颜色为绿色，成熟后颜色变为赤红色、黄色或绀青，以红色最为常见，常见的形状为圆锥形或长圆形[1]。它不仅是重要的蔬菜和调味品，具有极高的营养价值，补充人体需要的碳水化合物，维生素及钙、磷、铁矿物质等，同时还可入药，具有很好的保健功效，如驱寒止痛等功效[2]。然而，在辣椒广泛推广种植的同时，大面积种植辣椒也面临着各种病虫害以及疫病的威胁，造成辣椒的减产甚至绝收。使用化学药剂不能完全解决问题，反而会给环境和人类健康带来不可逆的危害。因此，防止辣椒疫病以及病虫害的关键是改良筛选抗病品种，提高辣椒自身的抗病性[3]。研究辣椒的天然免疫系统，是改良辣椒品种至关重要的理论基础。1.1植物的抗病机理1.1.1植物的天然免疫系统植物的生长和繁殖过程不仅面临着严峻的生态环境的挑战，同时还会受到各种病虫害以及疫病的侵染，但在长期的生物进化进程中，植物逐渐产生众多复杂合理的保护机制来抵御外界病原的入侵，上述机制如同植物免疫系统。上述系统通常被划分成不同层次，首先第一个层次是由病原体有关分子模式所催生的免疫反应(PTI)，植物模式分辨受体利用辨别和病原体相关的分子形式，刺激活化促丝裂原活化蛋白激酶信号通路，进而在植物内出现初期的应答反应，应用范围广泛，效果显著，可分辨与响应大部分类微生物，比如细菌鞭毛蛋白、脂多糖等非致病菌的大部分微生物，进而立即触发活性氧爆发、超敏反应、植物内抗毒素的形成和部分有关抗病基因的表达上述基础免疫。此类防御反应可以高效的限制病原菌的生长和控制疾病的进一步发展，这与动物的自然免疫相似。第二个层次是通过效应因子触发型免疫(ETI)来重塑植物的抗性，病原菌形成效应因子，促使众多因子蛋白被传送到植物细胞质内和宿主蛋白彼此影响，限制基础免疫反应，进而在植物内出现众多病原体，因此就和哺乳动物的适应性免疫类似。此外使用PTI与ETI，把双方融合起来，可以高效的增加植物抗菌谱，优化植物ETI抗性[4-5]。1.1.2植物的抗病反应特征细胞的衰老死亡贯穿于植物整个生长发育过程之中，随着不断的深入研究，细胞死亡被划分成两类：坏死和细胞程序性死亡（programmedcelldeath，PHD）。二十世纪末期，Greenberg[6]等最先表明植物细胞程序性死亡的精准定义，该专家分析得知，即便不存在病原体侵染，拟南芥acd2突变体植株依然能自主产生病斑，且具备动物PCD的突出特点。细胞程序性死亡通常出现在生物发育时期，其需要信号或众多分子参加，是由基因影响的细胞自主的有序的死亡形式[7]。在细胞出现此类死亡时，细胞质压缩，细胞表层皱缩，染色体有规律的断裂成大小不均匀的碎片，在开展琼脂糖凝胶电泳时可查看到DNA“梯状”条带，此外肉眼查看到众多病斑[8]。PCD不仅在植物生长发育过程中有重要作用，而且在抵御外界胁迫方面以及与植物的超敏反应都有着非常密切的关系[9]。超敏反应（hypersensitiveresponse，HR）概念最先由Stakman指出，是植物因为病原体入侵而出现自主局部细胞死亡，上述反应一般出现明显的PCD特征[10]。1.2硫氧还蛋白硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)普遍出现在动物、植物、细菌、酵母中，是一种分子量约为12kD的酸性小蛋白。1.2.1结构特征在硫氧还蛋白中存在很多的氨基酸残基，随着研究的深入和生物技术的发展，研究证明这些氨基酸残基对其蛋白结构和催化活性的重要性是不可忽视的。我们已经可以从植物中分离得到Trx，植物内大多数Trx都包含相对保守的外露活性中心，包含两个半胱氨酸残基。氧化态Trx的活性中心出现...