第五章细菌检验技术第一节细菌形态检验技术一、细菌染色标本镜检（一）染色标本检查的基本程序1、涂片2、干燥3、固定4、染色染料种类：碱性染料、酸性染料、中性染料，碱性染料最常用（1）单染法用一种染料进行染色，可观察细菌的大小、形态和排列，但不能用于鉴别细菌。如：亚甲蓝染色法（2）复染法用两种或两种以上的染料进行染色，不仅可以观察细菌的大小、形态和排列。还可用于鉴别细菌，又称为鉴别染色。•鉴别染色—革兰染色抗酸染色复染法的一般步骤初染－→媒染－→脱色－→复染5、镜检•显微镜：光学显微镜•所用放大倍数：10×100＝1000•所用镜头：油镜头•镜油：香柏油或石蜡油•香柏油折光率（n＝1.515）与玻片折光率（n＝1.52）接近•显微镜使用完毕须擦拭镜头。（二）革兰染色法1、染液组成：结晶紫染液、卢戈碘液、95％乙醇、稀释复红2、染色方法•标本涂片，固定结晶紫初染（1分钟）→碘液媒染（1分钟）→95%乙醇脱色（30秒）→复红复染（3-5分钟）→3、染色结果•兰阳性菌（G+）——紫色；•革兰阴性菌(G-)——红色。4、染色原理（1）渗透学说：与肽聚糖结构有关G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性屏障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，复红复染后呈红色。（2）化学学说：与细菌细胞质中核糖核酸镁盐有关（3）等电点学说：与细菌所带电荷有关5、临床意义•鉴别细菌•选择用药•理解细菌的致病作用6、影响因素（1）操作因素★涂片的厚薄★脱色时间的长短（2）染液因素★卢戈碘液放置时间过长★95％乙醇挥发★结晶紫与草酸铵混合时间太长（3）细菌因素：★细菌种类、★细菌菌龄（三）抗酸染色法用于鉴别抗酸杆菌和非抗酸杆菌步骤：1、苯酚复红加温染色2、盐酸酒精脱色3、亚甲蓝复染结果：抗酸杆菌为红色非抗酸杆菌为蓝色（四）其他染色法1、特殊结构染色法2、负染色法3、荧光染色二、细菌不染色标本镜检•应用：主要用于观察活菌的动力和运动方式•常用方法：压滴法、悬滴法、暗视野映光法压滴法载玻片细菌悬液盖玻片悬滴法镜检3、暗视野聚光法4、相差显微镜检查法（二）影响因素1、操作因素2、玻片因素3、光线强度第二节细菌接种与培养技术一、基本条件（一）接种环与接种针用于取菌、接种及分离细菌的器具1、接种针用于挑去单个菌落、穿刺接种及斜面接种2、接种环用于划线分离培养、纯种接种、挑取菌落和菌液以及制备细菌涂片。3、接种前后都应对接种环和接种针进行灭菌（二）红外接种环灭菌器利用红外线产热进行灭菌（三）培养皿制备固体培养基常用的器皿，用于细菌的分离培养。附：微生物检验常用玻璃仪器的准备1、玻璃器材的种类及用途2、玻璃器皿灭菌前的准备玻璃器皿在清洗、干燥后必须经正确的包裹和加塞后才能进行灭菌处理。3、玻璃器材的清洗★新购置的玻璃器材：1％～2％盐酸浸泡－→清水清洗★用过的无污染器皿：洗涤剂洗刷－→清水清洗细菌污染的器材：消毒灭菌后再洗刷★盛培养基试管和平皿：高压灭菌－→趁热倒出－→洗涤剂洗刷－→清水冲洗★吸管：3％来苏浸泡－→清水冲洗★玻片和盖玻片：3％来苏和清洁液浸泡－→清水冲洗；染色后的玻片，应肥皂水煮沸10min再洗涤★含油脂的器皿：单独灭菌（四）培养箱1、电热恒温培养箱2、二氧化碳培养箱3、厌氧培养箱（五）培养基培养基：是指人工配制的适合细菌生长繁殖的综合营养基质。1、培养基的成分及作用•营养物质：肉浸液、牛肉膏、糖醇类、血液、鸡蛋和动物血清、生长因子、无机盐•水•凝固剂：琼脂、明胶•抑制剂•指示剂2、培养基的种类（1）按培养基的物理性状分类•液体培养基：不含凝固剂，用于增菌和接种纯种细菌。•半固体培养基：含0.3％～0.5％琼脂，用于观察细菌的动力。•固体培养基：含2％～2.5％琼脂，多用于细菌的分离培养。（2）按培养基的用途分类•基础培养基：培养营养要求不高的细菌，如普通平板•营养培养基：能满足营养需求较高细菌的生长，如血平板•鉴别培养基：含有某...
