点击《基因工程中重组 DNA 的两次筛选》张辉运 343900 江西省遂川中学 基因工程的第二步构建基因表达的载体，即把用同一种限制酶处理的目的基因与运载体混合，再加入 DNA 连接酶，使 DNA 片段相同的黏性末端能够连接起来，因为这些 DNA 片段有相同的黏性末端，所以在 DNA 连接酶的作用下，必然形成一个封闭式的环状 DNA。这些环状 DNA 有的是由一个 DNA 片段形成的，共有两种，即目的基因环状物和运载体环状物；有的是由两个 DNA 片段形成的，共有三种，即目的基因—载体连接物、载体—载体连接物、目的基因—目的基因连接物。如何从如此多的环状物中找出具有目的基因的重组质粒呢？我们通过下面例题进行分析。【例】图 1 是将人的生长激素基因导入细菌 B 细胞内制造“工程菌”的示意图。已知细菌 B 细胞内不含质粒 A，也不含质粒 A 上的基因。判断下列说法正确的是（ ） A．将重组质粒导入细菌 B 常用的方法是显微注射法B．将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌C．将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的就是导入了质粒 A的细菌D．目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生长。【解析】筛选含目的基因的受体细胞，首先要选择质粒。如图 2 所示本题中所选用的质粒 A，同时具有青霉素抗性基因和四环素抗性基因，在操作中将目的基因插入到了四环素抗性基因中，这样将导致四环素基因不能表达。 在进行导入操作中，质粒自连的环状 DNA 和重组质粒都可以导入受体细胞，而目的基因自连环状 DNA 则不能导入，因此在导入操作后，混合物中有 3 种细胞：即多数没有导入任何质粒的受体细胞（普通细胞）、导入普通质粒（不含目的基因）的细胞和导入重组质粒的受体细胞（获得目的基因）。第一次筛选：将含有三细胞的混合物接种在含青霉素的选择培养基中培养，由于普通细胞不含有抗性基因，能够将导入普通质粒和重组质粒的受体细胞选出。第二次筛选：采用影印接种法，即用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆形木块上，构成印章（接种工具，图 3A 所示）；然后把前述经过第一次筛选长出菌落的母板倒置在丝绒的印章上，轻轻印一下（图 3B）；再把此印章在另一个含四环素的选择培养基（图 3D）的平板上印一下。这样，由于重组质粒的抗四环素基因被目的基因破坏，不能形成菌落的即为含有重组质粒的受体细胞...
