PCR技术详解VIP免费

PCR 技术概论 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是 80 年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一 DN***段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的 DNA 供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用 PCR 几小时便可完成。PCR 技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 PCR 技术简史 PCR 的最早设想 核酸研究已有 100 多年的历史，本世纪 60 年代末、70 年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana 于 1971 年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过 DNA 变性，与合适的引物杂交，用 DNA 聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆 tRNA 基因”。 PCR 的实现 1985 年美国 PE-Cetus 公司人类遗传研究室的 Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于 DNA 的体内复制，只是在试管中给 DNA 的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板 DNA ，寡核苷酸引物，DNA 聚合酶，合适的缓冲体系，DNA 变性、复性及延伸的温度与时间。 PCR 的改进与完善 Mullis 最初使用的 DNA 聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的 Klenow片段，其缺点是：① Klenow 酶不耐高温， 90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在 37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其 PCR 产物特异性较差，合成的DN***段不均一。此种以 Klenow 酶催化的 PCR 技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于 Klenow 酶不耐热，在 DNA 模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给 PCR 技术操作程序添了不少困难。这使得 PCR 技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。 1988 年初，Keohanog 改用 T4 DNA 聚合酶进行 PCR，其扩增的 DN***段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种 DN***段。但每循环一次，仍需加入新酶。 1988 年 Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA 聚合酶。 此酶具有以下特点：①耐高温，在 70℃下反应 2h 后其残留活性大于原来的 90%，在 93℃下反应 2h 后其残留活性是原来的 60%，在 95℃下反应 2h 后其残留活性是原来...