重组质粒的连接、转化及筛选第一节概 述质粒具有稳定可靠和操作简便的优点
如果要克隆较小的DNA 片段 (＜ 10kb) 且结构简单 ,质粒要比其它任何载体都要好
在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA 和目的 DNA 片段 , 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成
但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的
通过调整连接反应中外源DNA 片段和载体DNA的浓度比例 ,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略 ,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α 互补现象等来鉴别重组子和非重组子
外源 DNA 片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA 片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上
也可在PCR 扩增时，在DNA 片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连
2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端
由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有
所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA 的浓度 , 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平
还可将载体DNA 的 5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉 , 最大限度地抑制质粒DNA 的自身环化
带5'端磷酸的外源DNA 片段可以有效地与去磷酸化的载体相连 ,
