第二章 常用实验技术及方法 一、聚合酶链反应(Poly merase Chain Reaction, PCR) 反应总体积为50 µl，其中含有： 模板DNA 0.5 µl PCR缓冲液(不含MgCl2) 5 µl 10×MgCl2 溶液 5 µl dNTP (2.5 mmol/L) 0.5 µl 引物1 (50 umol/L) 0.5 µl 引物2 (50 umol/L) 0.5 µl Taq DNA 聚合酶 0.5 µl 无菌去离子水加至 50 µl 上层用25 µl 液体石蜡油覆盖。 循环参数为： 94 ℃变性10 min 94 ℃变性1 min 56 ℃退火1 min 72 ℃延伸2 min 共 30 个循取环，PCR 结束后，取 2 µl PCR 扩增产物，经 1 %琼脂糖凝胶电泳，在紫外检测仪上观察并拍照。 二、基于PCR技术的定点突变 1. 根据所要突变位点的特定氨基酸，并按公认的四引物法原理，分别设计上下游引物Primer 3和Primer 4，这两条引物部分交错互补，但分别含有欲突变后的碱基（红点）的互补序列（如下图所示）； 2. 用基因5’端的Primer 1和Primer 2 PCR扩增DNA片段1，用基因3’端的Primer4和Primer 3一起PCR扩增DNA片段2，PCR反应条件基本如上(七、聚合酶链反应)，可根据具体实验略有调整，反应完毕后，分别电泳回收DNA片段1和DNAP1 P2 P4 P3 片段2； 3. 以片段1和片段2为模板，进行第二次PCR反应，反应体系为50 µl： 片段1 1 µl 片段2 1 µl 10×PCR缓冲液(不含MgCl2) 5 µl 10×MgCl2溶液 5 µl dNTP (2.5 mmol/L) 5 µl Taq酶 1 µl 加ddH2O至 50 µl 在该反应体系中先不加入引物，按上述反应条件进行10个循环，然后再加入Primer 1和Primer 4各1 ul，按上述反应条件再扩增30个循环； 4. PCR 产物经电泳检查，然后连接到相应的载体中，进行测序以确定定点突变的正确性。 三、Total RNA的提取 (Catrimox -14TM RNA Isolation Kit Ver. 2.11 ) 1. 吸弃培养细胞中的旧培养基，用PBS洗涤1-2次后，加入1 m l的Catrimox-14TM溶液，然后充分混匀； 2. 收集细胞裂解液，按以下条件进行离心： 细胞数<5×105 ： 9500 rpm (约5 000×g) 5 min 细胞数5×105 - 1×107 ：3000 rpm (约450×g) 5 min 细胞数>1×107 ： 1500 rpm (约112.5×g) 5 min 3. 除去上层溶液，加入1 ml的DEPC处理的H2O，上下颠倒混合数次后， 12000 rpm离心2 min； 4. 吸弃上层溶液，激烈振荡使沉淀松动； 5. 向Microtube中加入1 ml的2 M LiCl溶液； 6. 激...
