2013-10-27 实 例 图 解 简 并 引 物 设 计 （By Raindy） 【絮语】 设 计 一 对 合 适 的 引 物 是 PCR 扩 增 目 的 基 因 成 功 的 关 键 ， 但 许 多 人 往 往 过 度 依 赖 Primer Premier（以下简称 PP）或 Oligo 等引 物 设 计 软件， 有时候引 物 没设 计 成 ， 却身陷软件之中无法自拔。其实， 不论特异性引 物 或简并引 物 ， 只要掌握了几个关 键 点， 手动也可以设 计 出一 对 好引 物 。如果不是 大批量设 计 引 物 或设 计 复杂的 引 物 序列， 下面的 四个常用工具即可轻松胜任引 物 设 计 任务。下文以马铃薯 Y 病毒 CP 基 因 简并引 物 设 计 为示例， 分享一 些个人 经验， 希望对 初学者能起个抛砖引 玉作用。受专业领域及水平所限， 文中有不当之处， 敬请各位同仁、童鞋批评指正。 【相关工具】 （1）MEGA5-多 重序列比对 、选取基 因 区域、序列编辑 （2）DNAMAN8-检测两引 物 的 互补性 （3）Oligo Calc-评估引 物 的 属性 （4）Web Lo go 3-直观显示简并碱基 -------------------------------------------------【华丽分割线】------------------------------------------------- 【基本原则】 设 计 一 对 好的 引 物 ， 归结起来就是 5′端引 物 、3′端引 物 之间以及两者与模板的 关 系处理得恰到好处： （1）两引 物 的 序列要与模板的 序列紧密互补； （2）两引 物 不能在模板的 非目 的 位点发生错配； （3）两引 物 之间尽量减少二聚体或发夹结构生成 。 【延伸原则】 （1）引 物 长度：常用为 18-27bp， 最大不可超过 38bp， 否则容易导致延伸温度 过 高，不适 合 DNA 聚合 酶反应； （2）GC 含量：一 般介于 40%-60%之间， 且两个引 物 之间的 GC 含量相差不能过 于悬殊； （3）碱基分布：随机分布最佳， 但 避免连续的 GC， GC 富集区容易导致错误引 发反应。 【特别注意】 5′端引 物 的 作用主要限定 PCR 产物 的 长度 ， 对 扩 增 特异性影响不大；引 物 的 延伸是 从 3′端开始的 ， 所以 3′端引 物 是影响特异性扩增的最关键因素 ， 因 此， 在实际设 计...
