基因克隆基本实验方法VIP免费

重 组 质 粒 的 连 接 、 转 化 及 筛 选 第 一 节 概 述 质 粒 具 有 稳 定 可 靠 和 操 作 简 便 的 优 点 。如 果 要 克 隆 较 小 的 DNA 片 段 (＜ 10kb)且 结 构 简 单 ,质 粒 要 比 其 它任 何 载 体 都 要 好 。 在 质 粒 载 体 上 进 行 克 隆 ,从 原 理 上 说 是 很 简 单 的 ， 先 用 限 制 性 内 切 酶 切 割 质 粒DNA 和 目的 DNA 片 段 , 然 后 体 外 使 两 者 相 连 接 , 再 用 所 得 到 重 组 质 粒 转 化 细 菌 ,即 可 完 成 。 但 在 实 际 工 作 中 , 如 何 区分 插 入 有 外 源DNA 的 重 组 质 粒 和 无 插 入 而 自 身 环 化 的 载 体 分 子 是 较 为 困 难 的 。 通 过 调 整 连 接 反 应 中 外 源DNA 片 段 和 载 体DNA 的 浓 度 比 例 ,可 以 将 载 体 的 自 身 环 化 限 制 在 一 定 程 度 之 下 ,也 可 以 进 一 步 采 取一 些特殊的 克 隆 策略,如 载 体 去磷酸化 等来最大限 度 的 降低载 体 的 自 身 环 化 ,还可 以 利用 遗传学手段 如 α互补现象等来鉴别重 组 子 和 非重 组 子 。 外 源 DNA 片 段 和 质 粒 载 体 的 连 接 反 应 策略有 以 下 几种： 1、 带 有 非互补突 出 端 的 片 段 用 两 种不 同 的 限 制 性 内 切 酶 进 行 消 化 可 以 产 生 带 有 非互补的 粘 性 末 端 ,这也 是 最容 易 克 隆 的DNA 片 段 ， 一 般 情 况 下 ,常 用 质 粒 载 体 均 带 有 多 个 不 同 限 制 酶 的 识 别序 列 组 成 的 多 克 隆位 点 ， 因 而 几乎 总 能 找 到 与 外 源DNA 片 段 末 端 匹 配 的 限 制 酶 切 位 点 的 载 体 ， 从 而 将 外 源 片 段 定 向 地 克 隆到 载 体 上 。 也 可 在 PCR 扩 增 时 ， 在 DNA 片 段 两 端 人 为 加 上 不 同 酶 切 位 点 以 便 与 载 体 相 连 。 2、 带 有 相 同 的 粘 性 末 端 用 相 同 的 酶 或 同 尾 酶 处 理 可 得 到 这 样 的 末 端 。 由 于 质 粒 载 体 也 必 须 用 ...