CRISPRCas9CAS9技术VIP专享VIP免费

CRISPR/Cas9Timelineofgenomeengineeringresearch1982年，利用同源重组的方法进行基因打靶。但是效率极低，因此应用受到限制。1998年，出现了第一代人工核酸内切酶技术——锌指核酸内切酶（ZFN）技术，锌指是一类能够结合DNA的蛋白质，ZFN是锌指蛋白与核酸内切酶FokI融合形成的核酸内切酶。2010年，出现第二代人工核酸酶——类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)技术。TALEN由DNA结合蛋白TALE与核酸内切酶FokI融合而成。这两种技术都是通过DNA结合蛋白靶向特异DNA结合后，在FokI核酸酶的作用下完成特定位点的剪切。2012年，仅仅时隔两年，出现了Cas9技术，它是由RNA指导的Cas核酸内切酶对靶基因进行修饰的技术。CRISPR/Cas9•CRISPR/Cas9是细菌和古生菌一种特殊的防御系统，能够有效地抵抗噬菌体和外界各种基因元件（如质粒）对其造成的干扰。可以将CRISPR/Cas系统分为：TypeI、TypeII、TypeIII三种不同类型。三类CRISPR/Cas系统中TypeII型系统的核糖核蛋白复合物相对简单，除crRNA和tracrRNA外，只有Cas9一个蛋白。目前，产脓链球菌的TypeII型系统是被改造的最为成功的人工核酸内切酶，已经在人类细胞、小鼠、斑马鱼中成功实现了基因组定点修饰。因此介绍typeII。TypeII基因座以产脓链球菌的典型TypeIICRISPR/Cas为例，其基因座结构可分别三部分，5'端为tracrRNA基因。中间为一系列Cas蛋白编码基因，包括Cas9、Cas1、Cas2和Csn2。3'端为CRISPR基因座，由启动子区域和众多的间隔序列(spacers)和重复序列(repeats)顺序排列组成。Cas9proteinfunction•Casnucleasehas:①RNAbindingdomain;②anα-helicalrecognitionlobe;③aPAM-interactingsite.④anucleaselobe:NHN：负责切割与crRNA互补的链RuvC：负责非互补链的切割因此，将RuvC或是NHN活性突变后Cas9只有单链切割活性，类似于切口酶Adaptiveimmunityinvolvesthreephases（作用机理）（1）CRISPR的高度可变的间隔区的获得：外来入侵的噬菌体或是质粒DNA的一小段DNA序列(protospacer)被整合到宿主菌的基因组，整合的位置位于CRRSPR的5'端的两个重复序列之间(repeats)。（2）CRIPSR基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工)：CRISPR基因座首先被转录成前体CRISPRRNA(pre-crRNA)，然后由tracrRNA指导，在Cas蛋白或是核酸内切酶的作用下被剪切成一些小的RNA单元，这些小RNA即为成熟crRNA，由一个间隔序列和部分重复序列组成．（3）CRISPR/Cas系统发挥活性，对外源遗传物质的干扰：成熟的crRNA与特异的Cas蛋白形成核糖核蛋白复合物，再与外源DNA结合并扫描到外源DNA，寻找其上的靶序列，crRNA的间隔序列与靶序列互补配对，外源DNA在配对的特定位置被核糖核蛋白复合物切割。PAM(protospacer-adjacentmotif)PAM是由3个成对碱基构成的序列，靠近靶DNA序列3’末端，可以促进靶序列的识别。化脓链球菌Cas9作为基因组修饰通用的工具，特异识别NGG和NAG的PAM序列（前者效率更高）。RNA-DNA异源双链体的形成是从PAM位点开始的，从而使得Cas9发挥活性，对DNA链进行切割。避免细菌自身免疫的发生宿主菌利用crRNA与靶序列配对结合介导外源DNA切割，而crRNA本身是由宿主菌的基因组为模板转录出的pre-crRNA经加工后形成的，这就是说相同的靶序列也存在于宿主的基因组中，那么CRISPR/Cas系统应该有一套机制将自身序列和外源的靶序列区分开。宿主菌的CRISPR基因座位的间隔序列(spacer)临近位置不存在PAM，而靶序列临近有PAM，在PAM序列crRNA不能配对，只有不完全的配对才允许核糖核蛋白复合体发挥切割活性，，通过这样的机制CRISPR/Cas系统避免自我免疫。UseofCRISPR/Cas9forgenomeeditingtracrRNA:crRNA改造成一条嵌合的sgRNA，发挥tracrRNA和crRNA的功能，包括两部分：DNA互补序列（一般20核苷酸），相当于crRNA；双链结构，可以结合Cas9，相当于tracrRNA。在sgRNA指导下，Cas9内切酶对特定位点的DNA进行切割，产生DSB，然后细胞会借助同源定向修复（HDR）或者非同源末端连接机制（NHEJ）对断裂的DNA进行修复。对于HDR，当提供同源模板，可产生精确的序列修饰，插入特定序列；对于NHEJ，可以导致插入或缺失Off-targeteffectOff-targeteffect:thet...