电脑桌面
添加小米粒文库到电脑桌面
安装后可以在桌面快捷访问

影响PCR的主要因素VIP免费

影响PCR的主要因素_第1页
1/5
影响PCR的主要因素_第2页
2/5
影响PCR的主要因素_第3页
3/5
影响 PCR的主要因素PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA,然后才进行自动热循环,最后进行产物鉴定与分析。引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行, 临床应用只需购买PCR检测 试剂 盒就可开展工作, PCR自动热循环中影响因素很多,对不同的DNA样品, PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下。一、温度循环参数在 PCR自动热循环中,最关键的因素是变性与退火的温度。如操作范例所示,其变性、退火、延伸的条件是:94℃60s, 37℃60s, 72℃120s,共 25~30 个循环,扩增片段500bp。在这里,每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要30~ 60s,这一迟滞时间的长短取决于几个因素,包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源(水浴或加热块)以及两步骤间的温度差,在设置热循环时应充分给以重视和考虑,对每一仪器均应进行实测。关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离;距离越远,合成靶序列全长所需的时间也越长,前文给出的反应时间是按最适于合成长度500bp 的靶序列拟定的。下面就各种温度的选择作一介绍。1.模板变性温度变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度, 达不到变性温度就不会产生单链DNA模板,PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全,DNA双链会很快复性,因而减少产量。一般取90~95℃。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种,时间过久没有必要;反之,在高温时间应尽量缩短,以保持 Taq DNA聚合酶的活力,加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。2.引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量;温度高特异性强,但过高则引物不能与模板牢固结合,DNA扩增效率下降;温度低产量高,但过低可造成引物与模板错配,非特异性产物增加。一般先由37℃反应条件开始,设置一系列对照反应,以确定某一特定反应的最适退火温度。也可根据引物的(G+C)%含量进行推测,把握试验的起始点,一般试验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度TTm(melting temperature)低 5℃,可按公式进行计算:Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) - 5℃其中 A,T,G,C分别表示相应碱基的个数。例如,20 个碱基的引物,如果(G+C)%含量为 50%时,则 Ta 的起点可设在 55℃。在典型的引物浓度时(如0.2 μ mol/L ...

1、当您付费下载文档后,您只拥有了使用权限,并不意味着购买了版权,文档只能用于自身使用,不得用于其他商业用途(如 [转卖]进行直接盈利或[编辑后售卖]进行间接盈利)。
2、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。
3、如文档内容存在违规,或者侵犯商业秘密、侵犯著作权等,请点击“违规举报”。

碎片内容

影响PCR的主要因素

确认删除?
VIP
微信客服
  • 扫码咨询
会员Q群
  • 会员专属群点击这里加入QQ群
客服邮箱
回到顶部