影响PCR的主要因素VIP免费

影响 PCR的主要因素PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行， 临床应用只需购买PCR检测 试剂 盒就可开展工作， PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品， PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下。一、温度循环参数在 PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共 25～30 个循环，扩增片段500bp。在这里，每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要30～ 60s，这一迟滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源（水浴或加热块）以及两步骤间的温度差，在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器均应进行实测。关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离；距离越远，合成靶序列全长所需的时间也越长，前文给出的反应时间是按最适于合成长度500bp 的靶序列拟定的。下面就各种温度的选择作一介绍。1．模板变性温度变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度， 达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般取90～95℃。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种，时间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持 Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。2．引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般先由37℃反应条件开始，设置一系列对照反应，以确定某一特定反应的最适退火温度。也可根据引物的（G+C）%含量进行推测，把握试验的起始点，一般试验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度TTm(melting temperature)低 5℃，可按公式进行计算：Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) - 5℃其中 A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。例如，20 个碱基的引物，如果（G+C）%含量为 50%时，则 Ta 的起点可设在 55℃。在典型的引物浓度时（如0.2 μ mol/L ...