影响Westernblot的因素VIP免费

Western blotting的影响因素（一）：电泳Western blotting 是一个步骤繁多的实验。很多的操作过程， 每一步都会对最后的结果产生影响，接下来的这几个帖子我想把我这段时间做Western blotting 总结的一些影响实验结果的因素写下来，如果你有更好的建议，希望也能贡献出来，大家一起学习进步。电泳过程是第一步，也是很重要的一步，好的电泳能让目的条带整齐，就像人工画的。 要做好电泳也并非易事，我总结有这些方面的因素能影响电泳效果：1. 样品质量。所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH 值是否在 7~8 之间。 这会直接影响到样品浓缩的效果。此外， 蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。2. 凝胶质量。不连续SDS-PAGE 胶对凝胶的要求较高，具体的影响因素有：1.分离胶的PH 值应在 8.8 左右，而浓缩胶的PH 应在 6.8 左右，最好不要差过0.5 个 PH 单位，因为这个 PH 条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件，也是保证能充分压缩样品的前提。因此，制备凝胶的时候所用Tris-HCl 缓冲液的 PH 值是否稳定是很重要的。2.所用丙烯酰胺的纯度和凝胶聚合时间，不纯的丙烯酰胺会含有丙烯酸，它会影响到凝胶内部局部PH 环境，因此会影响电泳的效果，没有聚合充分的凝胶会含有游离的丙烯酰胺，也会影响到局部PH环境， 它们还会与蛋白上的氨基、巯基以及酚羟基反应影响蛋白的泳动。凝胶聚合时间以分离胶 >45min ，浓缩胶 >20min 为宜。此外，单体放置时间过长也会造成丙烯酸的累积。3.凝胶母液混合是否均匀也会影响到凝胶浓度的分布。4.配备的母液中丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的比例也会影响到网孔的大小，因此也会对电泳的质量有影响，一般取（30~40）：1，特殊要求的实验也可以灵活变动。5.APS 及 TEMED 的加入量， APS 极易潮解而失去活性，因此最好是现用现配，APS 不宜加入过多，否则会氧化蛋白样品。TEMED 作为加速剂，有利于氧自由基的富集，从而加速聚合反应，因此所用的TEMED 尽量不要被氧化 （氧化后发黄） ，还有加入的TEMED 也不宜过多或过少，过多会升高PH 值并能与蛋白反应，过少则会造成聚合不充分， 网孔变大， 并且造成游离丙烯酰胺单体的增多，它们也会和蛋白反应以及改变局部 PH。6.点样孔底部要平整。3. 点样。样品尽量不要与电泳液混合，这样能提高浓缩的效果，因为电泳液PH 值为 8.3，而样品为7.5，混合后会影...