MTT实验方法VIP免费

一、 原理 黄色的噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT 还原为难溶于水的蓝紫色的针状Formazan 结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。 二、实验步骤（实用于贴壁细胞） 1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96 孔板，每孔180μ l，3000-10000 个/孔。 2）置37℃、5%CO2 温箱培养使细胞贴壁，培养 6-24 小时。 3）加入待筛样品 20μ l，继续培养 44 小时。 4）小心吸去上清，加入80μ l 新鲜 RPMI 1640 培养液，再加入20 ul MTT 溶液（5 mg/ml，即 0.5%MTT），继续培养 4 h。 6）然后吸掉上清，每孔加入150 ul 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm 处测量各孔的吸光值。 7） 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3 复孔。 8） 计算抑制率＝[(对照-空白)-(给药-空白)]/(对照-空白)X100%.有依据吗 MTT 分析法以活细胞代谢物还原剂 3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT 噻唑蓝为基础。MTT 为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素 C 的作用下 tetrazolium 环开裂，生成蓝色的formazan 结晶，formazan 结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将 MTT 还原）。还原生成的formazan 结晶可在含 50%的N,N-二甲基甲酰胺和 20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT 溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD 值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO 来溶解。 MTT 粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 MTT 步骤如下： 1：接种细胞：用含 10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔 1000－10000 个细胞接种到 96 孔板，每孔体积 200ul. 2:培养细胞：同一般培养条件，培养 3－5 天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。 3：呈色：培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml 用PBS 配)20ul. 继续孵育 4 小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再...