2021/7/261(最新整理)蛋白质的提取与分离分离2021/7/26中英联合实验室33.1蛋白质样品制备目前，二维聚丙烯酰胺凝胶电泳依然是大多数蛋白质组研究中复杂蛋白混合物的核心技术。而选择合适的样品制备方法对获得满意的二维电泳图谱是十分重要的。对不同类型的蛋白进行样品制备时，需要采用不同的方法和条件。溶解的效果依靠选择的细胞破碎方法、蛋白解聚和溶解方法、去污剂和裂解液成分等来实现。样品制备的原则1.尽可能采用简单方法，以避免蛋白丢失；2.细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白质的降解，低温和蛋白酶抑制剂可防止蛋白质的降解；3.样品裂解液应新鲜制备，并分装存于-80℃。勿反复冻融已制备好的样品；4.通过超速离心清除所有的杂质；5.加入尿素之后加温不要超过37℃，防止氨甲酰化而修饰蛋白。温和的裂解方法用于组成比较简单的样品，或分析某一特定的细胞器。常用方法：（1）渗透裂解：血细胞、组织培养细胞（2）冻融裂解：细菌、组织培养细胞；液氮冻融（3）去污剂裂解：用去污剂溶解细胞膜、裂解细胞，释放内容物；用于组织细胞（4）酶裂解细胞：植物、细菌和真菌等含有细胞壁的细胞细胞裂解时，蛋白酶释放出来，会影响二维电泳的结果，因此需采取措施抑制蛋白酶的活性。常用策略：（1）直接加入强变性剂（2）低温、碱性条件下进行样品制备（3）使用蛋白酶抑制剂（PMSF、Proteaseinhibitorcocktail)蛋白酶抑制剂硫酸铵沉淀（盐析）TCA沉淀（三氯醋酸沉淀）丙酮沉淀在丙酮中加TCA沉淀用苯酚提取，随后在甲醇中用醋酸铵沉淀1.盐离子、痕量缓冲液和其它带电荷的小分子-透析2.内源小分子（如核苷酸、代谢物和磷酸）-TCA/丙酮3.离子去污剂-丙酮or低温沉淀4.核酸（RNA、DNA）-DNase/RNase5.多糖-硫酸铵or苯酚/醋酸胺6.脂类-去污剂7.酚类组分-PVP8.不溶物质-离心可溶性样品制备如血清、血浆、尿样、脑脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。组织样品制备细胞样品制备体外悬浮培养生长的细胞或周期性细胞样品（如红细胞、淋巴细胞）样品分级真核生物组织蛋白质经过很少的前处理便可进行2-DE分析。蛋白浓度高的样品，如血清、血浆，可用适当样品溶解液稀释后直接分析；含有较低蛋白质浓度或较高盐浓度的样品，可通过透析或液相色谱脱盐，通过冻干、对聚乙二醇的透析或TCA/丙酮沉淀的方法进行浓缩。细胞样品制备细胞样品理想的方法是通过离心收集，随后用磷酸盐缓冲液清洗并溶于样品缓冲液。对于固体基质中培养的细胞，应先除去培养基质，用PBS或等渗蔗糖溶液清洗细胞层，然后再通过刮擦法收获细胞；或者加入体积裂解缓冲液，直接将基质上的细胞裂解。样品预分级（1）蛋白质溶解性进行分级（2）蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行分级，如专门分离出细胞核、线粒体或高尔基体等细胞器的蛋白质成分（亚细胞分级）。样品预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测，还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行研究。DetergentFractionationCellsExtractionwithDigitonin/EDTACytoplasmicFractionExtractionwithTritonX100/EDTAsupernatentpelletsupernatentpelletsupernatentpelletExtractionwithSDS/EDTAOrganelleMembranesNuclearCytoskeletal(inSDS)SubcellularFractionationHumanmitochondrialproteinsHumannuclearproteins实例1.膜蛋白2.核蛋白膜蛋白的提取与分离膜蛋白指多肽链跨越脂双层数次的蛋白，被定义为膜整合蛋白或膜内在蛋白。膜内在蛋白的跨膜结构域必须折叠形成α螺旋或β片层的二级结构，膜蛋白处于细胞边界，在细胞的各种生命活动中发挥重要作用。核蛋白的提取与分离许多细胞核蛋白属于中等溶解度的，所以联合尿素、硫脲和去污剂裂解核蛋白，可达到足够的分辨率。核基质是Bereaney和Coffey在1974年提出的概念，指非染色质结构蛋白及核表面经高盐离子、核酸酶、去污剂抽提后所剩的核蛋白网状结构。细胞液缓冲液（0.5％TritonX-100、1.2mol/L蛋白酶抑制剂）离心沉淀提取液415min℃离心沉淀消化液室温30min离心沉淀（核基质蛋白和中间丝）溶于8mol/L尿素的蛋白裂解液透析除去尿素超速离心上清液核蛋白的提取核膜含有几个...
