环境DNA技术在水生生物调查中的应用M180100117白洁前言水生生物是全球生物多样性的重要组成部分，是近年来生物多样性保护的重点对象。相对于陆生动物，水生生物特殊的生存环境、生活习性及相对滞后的资源调查方法，使得众多水生物种缺少基础的生物学信息，如种群分布区、种群组成和种群动态等，这些信息的缺乏阻碍了水生生物保护生物学研究的开展，亟需一种新的资源监测方法改变这一现状。01环境DNA简介02环境DNA的实验流程030405濒危物种调查中的应用环境DNA的不足与展望入侵物种调查中的应用目录CONTENT环境DNA简介01环境DNA简介环境DNA是指生物与环境互作遗留的DNA，可能来源有生物脱落的组织、分泌物、排泄物、血液和尸体等，分布在土壤、沉积物、冰芯和自然水体等环境中，是生物完整和片段化DNA的混合物。环境DNA环境DNA技术是指从环境样品(土壤、沉积物和水体等)中直接提取DNA片段后利用测序技术进行定性或定量分析的方法环境DNA技术环境DNA发展历史BDACTheAmericanBullfrog(Lithobatescatesbeianus)wassuccessfullyidentified,showingthatearlydetectionofinvasivespeciesatlowdensitiesispossibleandhasimplicationsformanagementFreshwaterEnvironmentalDNAasamethodtoassessthediversityofmacro-organismalcommunitieswasfirstappliedtosedimentsrevealingDNAfromextinctandextantmammals,birdsandplants,followedbydrycavesediments,Later,itwasshownthatalsoDNAfrominvertebratessuchasinsects,aswellasfungisedimentsMetabarcodingofeDNAfromsurfacesoilhasthusefficientlybeenusedasaproxyforplanttaxonomicdiversityinseveraldifferentterrestrialecosystemssoil‘‘EnvironmentalDNA’’arosewiththeideaofobtainingnucleicacidsofmicrobesdirectlyfromenvironmentalsamplesmicrobial环境DNA的实验流程02环境DNA的实验流程样品的现场采集01结果分析04DNA扩增与测序0302样品的保存与DNA的提取直接采集水样或者现场过滤，样品的体积一般为2L，采样点尽量覆盖目标区域，每个样点重复三次水样保存在-4摄氏度，24h内提取，滤膜保存在-20摄氏度，针对不同的研究对象应该采取不同的提取方法，以达到最佳的提取效果。利用引物进行PCR，可以判断出样品中是否包含目标水生生物的DNA识别片段，再进行测序便可得到该片段的序列。测序后，用BLAST可将所得序列与GenBank所储存的序列进行比对，BLAST可依据与该序列的相似度给出一系列DNA序列以及它们的物种信息。样品的现场采集01在收集水样时直接对其进行过滤，如利用蠕动泵抽取水样时，将过滤设备连接在管线中，记录水样体积后，只需将滤膜保存带回即可。（也可使用filter手动过滤）现场过滤02一种是先利用蠕动泵、采样器等采样工具进行水样收集，再单独进行过滤，2步分开进行，但都在野外；第二种是水样采集-保存-实验室过滤则是完成水样收集后，采取适当的措施将水样保存，带回实验室后再进行过滤，研究表明野外过滤的效果最好采样后过滤滤膜孔径一般选取在0.45um左右，水样采集的体积从15ml-5L不等，一般来说都是采集1-2L,从同一水域多次采集得到，一般每个样品做3-10个平行样，尽量覆盖采集区域以增加检测到目标物种的概率。样品的保存与DNA的提取现场过滤是将所得滤膜直接存储在－20℃冰箱。水样的保存一般是加3mol·L-1乙酸及无水乙醇，而且水样采集后应该尽快提取DNA，最长不超过24h。在运输时应该避光低温保存，一般4摄氏度，避免水样出现冰冻融化过程造成DNA降解。不过滤的水样可以使用化学沉淀法，使用2.5倍体积的无水乙醇或0.6倍体积的异丙醇使水样里的DNA沉淀，然后离心提取DNA，还可以通过氯仿、细胞物理裂解、二氧化硅和DNA快速试剂盒等方法提取水样中的DNADNA扩增与测序结果分析鱼类研究案例环境DNA优点pros04030201IndependenceofweatherconditionSensitivity+Cost-effectivenessNon-invasivenessStandardization环境DNA研究现状入侵物种调查中的应用03入侵物种调查中的应用Asiancarpssilvercarp(Hypophthalmichthysmolitrix)andbigheadcarp(H.nobilis)入侵物种调查中的应用CrayfishProcambarusclarkii濒危物种...
