一．细胞培养技术 细胞周期的测定 一、原理 细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。 单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。 测定细胞周期的方法很多，有同位素标记法、细胞计数法等，这里介绍一种利用 BrdU 渗入测定细胞周期的方法。 BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞 DNA 复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含 BrdU 的 DNA 将占 l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。 二、仪器、用品与试剂 1、仪器、用品：同常规细胞培养 2、试剂：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa 染液，秋水仙素，2×SSC 液 三、操作步骤 1、细胞生长至指数期时，向培养液中加入 BrdU，使最终浓度为 10μ g/ml。 2、44 小时加秋水仙素，使每ml 中含 0.1μ g。 3、48 小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。 4、常规染色体制片（见第三部分：染色体技术）。 5、染色体玻片置56℃水浴锅盖上，铺上 2×SSC 液，距紫外灯管6cm 处紫外照射30 分钟。 6、弃去2×SSC 液，流水冲洗。 7、Giemsa 液染色 10 分钟，流水冲洗，晾干。 8、镜检100 个分裂相，计第一、二、三、四细胞期分裂指数。 9、计算： 细胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小时） 附：（1）BrdU 配制: BrdU 10mg 十双蒸水10ml 4℃下避光保存。 （2）2×SSC 配制: NaCl 1.75 克，柠檬酸三钠·2H2O 0.88 克，加水至100ml，4℃保存。 细胞的冻存和复苏 一、原理 在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH 改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。 细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。 目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小...
