免疫共沉淀CoIPVIP免费

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,CoIP）免疫沉淀反应（Immunoprecipitation，IP）免疫沉淀反应主要用于抗原或抗体的定性检测。其原理是指可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情况下，按适当比例所形成的可见沉淀现象。根据此现象设计的沉淀实验主要包括：絮状沉淀实验，环状沉淀实验和凝胶内沉淀实验。3是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。免疫共沉淀CoIP：CoIP原理当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。6CoIP优点1.相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；2.蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；3.可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。CoIP缺点1.可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用2.两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；3.如用westernblot检验，必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果。CoIP流程示意图WestenBlotting实验流程查阅文献，分析可能与哪些未知蛋白发生相互作用构建带有不同标签的真核表达质粒将带有标签的候选基因质粒以及TRAF7质粒共转染293T细胞转染24-48h后收集细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min，细胞裂解液于4℃最大转速离心30min后取上清。pRK-Flag-TRAF7pRK-HA-PPP2CA，HSP90AA1，RIPK2，SERPINE2低离子浓度（<120mMNaCl)NP40,TritonX-100等12取少量裂解液以备westernblot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4℃缓慢摇晃孵育过夜将预处理过的10μlproteina琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4℃缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与proteina琼脂糖珠偶连取10μlproteina琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3,000rpm离心3min免疫沉淀反应后，在4℃以3,000rpm速度离心3min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×sds上样缓冲液，沸水煮5min抗体过多易导致浪费，且不易沉降在微珠上抗体过少不能检测出抗原琼脂糖珠过多导致浪费琼脂糖珠过少，不能与抗体有效结合SDS-PAGE•十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，polyacrylamidegelelectophoresis)可对蛋白质组分进行分离，并可精确测得蛋白质的分子量。常用的方法为SDS-PAGE不连续系统•凝胶由两种不同的凝胶层组成。浓缩胶具有堆积作用，将较稀的样品，经过大孔径凝胶迁移作用被浓缩至一个狭窄的区带。分离胶将不同大小的蛋白分离开来14SDS-PAGE胶板选择根据样品数和上样量数选择适合尺寸的胶板和相应的样品梳。小型垂直电泳系统分离胶10%（10mL）浓缩胶4mlH2O4mlH2O2.7ml30%丙烯酰胺3.3ml30%丙烯酰胺0.67ml1.5MTris(pH8.8)2.5ml1MTris(pH6.8)0.5ml10%SDS0.1ml10%SDS0.04ml10%过硫酸铵0.1ml10%过硫酸铵0.04mlTEMED0.004mlTEMED0.004ml胶浓度选择根据待检测样品的分子量，选择合适浓度分离胶，具体配置查阅分子克隆。洗玻板、装玻璃板检漏、灌分离胶、灌浓缩胶，插梳子。阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，断裂分子内和分子间氢键，去折叠，消除电荷和分子结构的影响。促凝剂加速剂聚合后形成交叉网状结构，使其产生分子筛效应。电泳•Tris-甘氨酸电泳缓冲液1L：12.1g甘氨酸3gTris碱1gSDS•电泳条件：70V恒压30min；120V恒压1-1.5h（具体时间根据分子量大小，及预染Marker指示位置）。转膜准备工作（湿转法）•转膜缓冲液配置（预冷）1L体系：12.1gTrisbase14.4gGlycine5%-20%甲醇•滤纸：略比胶小。•醋酸纤维膜：略比胶大，根据蛋白质分子量可以选择不同规格的，0.22μm；0.45μm•先用甲醇平衡60s后，浸泡于转膜缓冲液中。转印滤垫—滤纸（三到四层）—蛋白胶—膜—滤纸—滤垫80V恒压，转印45-60min。根据分子大小来确定转印时间。21WesternBlotting•封闭（含5%脱脂奶粉TBST封闭1h）•洗膜（TBST洗膜三次...