【试剂】1、 3%茚三酮试剂称 3g 茚三酮用 95%乙醇溶解定容到100ml 容量瓶里 , 贮于棕色瓶中 . 此试剂应放在冷凉处, 不宜久放 , 使用期约10 天. 2、 氰酸盐缓冲液（按以下方法配制）：（1）NaCN贮备液 0.01mol/L （490mg/L）. （2）醋酸缓冲液： 称 360g 醋酸钠（含三分子结晶水） 溶于约 300ml 无氨蒸馏水中 , 加 66.67ml冰醋酸再用无氨蒸馏水稀释至1L. 取溶液（ 1）20ml, 用溶液（ 2）定容到1L. 3、标准氨基酸精确称取在80℃下烘干的亮氨酸13.1mg（或 α - 丙氨酸 8.9mg）溶于 10%的异丙醇中 , 并在 100ml 容量瓶中用10%异丙醇稀释至刻度, 混匀 , 即为 1mmol/L 的标准氨基酸贮备液 , 置冰箱中保存 . 为了制备工作液, 可取贮备液与等量无氨蒸馏水混合, 此液浓度为0.5mmol/L, 即 1ml 含氨基酸 0.5 μ mol, 或氨基氮 7μ g. 4、 95%乙醇；5、异丙醇（分析纯）. 【操作步骤】1. 标准曲线的制作取 20ml 刻度试管18 支, 按下表 15-1 加入各试剂 . 加完试剂后混匀, 在 100℃水浴中加热 12min（加热时封口）, 取出在冷水中迅速冷却, 立即于每管中加入5ml 95%乙醇 , 塞好塞子, 猛摇试管 , 使加热时形成的红色产物被空气中的氧所氧化而褪色, 此时溶液呈蓝紫色. 于570nm波长下测其光密度（以空白管为参比）, 以氨基酸浓度为横坐标, 光密度为纵坐标, 绘制标准曲线 , 求出直线方程 . 表 15-1 各试管加入试剂量2. 样品提取选取有代表性的植物叶片（或其它组织） , 洗净擦干 , 剪碎混匀 , 迅速称取0.10~0.20g（ 视氨基酸含量多少而定）, 共称 3 份, 分别加入20ml 刻度试管中 , 再加蒸馏水10ml 盖塞（或系上塑料薄膜） , 置沸水浴中20min 以提取游离氨基酸, 到时取出在自来水中冷却, 把上清液滤入 25ml 容量瓶中 , 之后再往试管中加5ml 蒸馏水 , 置沸水浴上再加热10min, 过滤并反复冲洗残渣 , 最后定容至刻度, 摇匀 . 3. 样品测定另取 4 支洁净干燥的试管, 其中 3 支分别加入0.5ml 提取液 , 另一支加 0.5ml 蒸馏水 , 然后在上述 4 支试管中分别加入NaCN缓冲液、水合茚三酮各 0.5ml,加完试剂后盖塞, 置沸水浴上加热 12min, 冷却后 , 再分别加 5ml 95%乙醇 , 摇匀 , 以空白作参比 , 在波长 570nm下测其光密度 . 根据光密度查标准曲线（或用回归方程计算）即可求出提取液中氨基酸的浓度. 4. 计算游离氨基酸含量式中 C- 由直线方程计算的值, 即 0.5ml 试样中氨基酸的微摩尔数（μ mol）； V-样品提取液经稀释后的总体积（ml）； W-样品重（ g） . 测定结果按表15-2 记录 . 表 15-2 游离氨基酸总量测定记载表测定日期：
