WesternBlot 问题解答 1.凝胶肿胀或卷曲:注意转膜之前,切割下来的凝胶一定要在转膜缓冲液中浸泡平衡5-10分钟,要含有20%的甲醇。 2.条带歪斜、或漂移 因为转膜仪使用时间太长,两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄。当按照阴极-海棉-滤纸-胶 -膜 -滤纸-海绵依次放好后两块板不能压紧,因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙,电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走,形成如图所示的形状。使用十几张普通的草纸垫在两块海棉之间,条带就可以变得非常的漂亮。 另外,转膜时转膜液一定要浸没凝胶和膜,否则也可能出现上述情况。 3.单个或多个白点:转膜时在膜与胶之间有气泡。做三明治时一定要逐层压紧,赶尽气泡。同时转膜液要提前配置好,加好甲醇,保证转膜前夜体内气泡排净。气泡存在的局部会抵抗蛋白转膜,降低转膜效率。 4、转膜缓冲液过热: 缓冲液离子强度太低,或电压及电流过高。按照上述方式配液,同时转膜过程中注意降温。我在冰水混合物中转膜,效果很好。 5 背景过高! 1)封闭不全,我用5%-10%的光明脱脂奶粉,效果还可以,现在做基本上没什么背景。如果你觉得不够可以加点BSA,1%吧。 2) 一抗或者是封闭液与膜蛋白的交叉反应。这种情况通常可以通过加入TWEEN-20 或多次洗膜加以解决。如果问题不能解决,那么降低一抗浓度,或更换封闭液种类可能解决 3)一抗二抗中某些不纯的物质也可以造成背景。 4)抗体浓度太高,或孵育时间太常都可能遇到这种情况。那么可以适当降低一抗二抗的浓度,或是用提高温度的方式来代替杂交时间的延长;另外,少量多次得洗膜效果要优于多量而长时间得洗膜效果。 5)曝光时间的控制。通常我们线曝光一分钟试试,条带清晰背景也强,可以缩短曝光时间,或者过一段时间等荧光减弱以后再发光,一般也可以发出比较好的条带。如果背景强于条带,那么肯定是前面默默个原因的一种,这是可以将膜在TBST 中漂洗以下再发光,有时会有比较好的效果(仅限于国外较好的试剂盒,国产的不行,洗一下啥也没了!)这个时候可以洗膜,洗膜后重新发光。 6、没有信号: 1)用单抗时比较容易出现这种情况。因为单抗主要是针对天然蛋白,这个时候.TWEEN-20 的作用就显现出来了,它可以增加抗原抗体复合物与膜的结合。 2)确信你的蛋白表达 3)确信蛋白高效的转移到你的膜上 4)一抗二抗的效价问题。无论哪个无效都不能发光,因此预实验一定要从最低的稀释度开始,以排除抗体的因素 5)ECL 试剂盒质量的问题...