浅析梯度PCR

浅析梯度 PCR PCR 技术从发明至今已有二十多年的时间，用于 PCR 实验的仪器不断的推陈出新。 然而 PCR 的基本过程没有太大变化， 包括变性 -退火-延伸这三步。 当研究者进行 PCR 实验获得的结果不理想时， 他们需要对 PCR 的组成要素进行优化。这其中包括反应条件、使用试剂的量甚至是引物等， 在这里我们不一一介绍了。 很多研究者在进行PCR 优化时都会考虑退火温度的优化，这时就会进行梯度PCR 。而为什么要通过梯度PCR 来优化以及如何解决梯度PCR 优化后所不能解决的问题， 这些对很多研究者来说可能并不是很清楚，本文中将会对此作一浅析。梯度 PCR 是针对每台 PCR 仪如何设置合适的退火温度进行摸索。它是以合成引物的退火温度为参考值，在进行同一个PCR 反应时，同时设置多个退火温度进行PCR 实验。这些退火温度呈现梯度递增或递减，通过梯度PCR 最终确定适合仪器的退火温度。虽然我们可以通过梯度PCR 摸索出适合仪器的退火温度，但在实际应用中仍然会遇到诸多困难。例如我们在一台PCR 仪上摸索出合适的退火温度，当换到另一台仪器（同一型号）上进行相同PCR 实验时，有时获得的结果会不理想；在一台PCR 仪摸索出的退火温度，换到其它品牌或型号的PCR 仪上时，获得的结果也是不理想；使用一种耗材获得好的实验结果， 当更换其它耗材时， 同样获得不理想的结果等。遇到上述状况时， 有时研究人员往往会很困惑，这是什么原因造成的？如何解决呢？我们不禁要问， 难道我们设计和合成引物时推荐的退火温度不够准确吗？为什么还需要摸索适合仪器的退火温度呢？带着这些疑问，我们首先从 PCR 仪本身来了解一下出现上述问题的原因。我们知道在 PCR 仪上设置的温度是模块温度，但由于受到模块的材质及热传导效率、 PCR 反应管的厚度及与模块贴合的紧密性等因素的影响，模块的热能不能 100% 传递到反应管中， 这就导致了模块温度与反应管中的温度的不一致性。 例如银质模块会比铝制模块导热性能好；薄壁的 PCR 管比厚壁的导热性能高；另外，反应管与模块的贴合的紧密程度来看， 贴合越紧密导热性能越好。 图中显示出反应管与模块之间存在一定的间隙这种情况会导致一定的热量损失（图1）。所以出现上述状况的原因是由于模块温度与样品温度的不一致性造成的。图 1. 模块与反应管贴合示意图那究竟模块温度与样品温度存在多大差异呢？我们对PCR 反应时模块温度与样品内部温度进行实时监测，并绘...