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无MTX加压方法简介诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点，己迅速成为制药工业中一个引人注目的领域。1995年美国基因工程药物销售额约为48亿美元，1997年超过60亿美元，年增长率达20%以上。各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。基因工程药物研发的主要环节包括：基因克隆和工程菌构造；重组细胞培养；目的产物分离纯化等。针对以上主要环节，研究人员正致力于高效表达、培养工艺及下游分离纯化等方面的研究。目前已有多种表达系统应用于表达具有医疗价值的蛋白质，如大肠杆菌、酵母、昆虫杆状病毒系统、哺乳动物细胞等表达系统。大多数药用蛋白都是糖蛋白，中国仓鼠卵巢细胞（CHO）是目前重组糖基蛋白生产的首选体系，已有越来越多的药用蛋白在其中获得了高效表达，部分药物已投放市场，例如EPO、G-CSF、组织型纤溶酶原激活剂t-PA、CD受体、单克隆抗体、乙型肝炎表面抗原、白介素、干扰素等。影响重组蛋白在CHO细胞中表达的因素很多，层次也很广泛，涉及CHO细胞表达体系、表达载体系统、外源基因、表达细胞株的加压扩增与筛选、细胞大规模培养等。转录是真核基因表达调节的基本控制点，研究表明：所有提高转录水平的策略主要通过载体构建、基因转染方法和选择不同标记来调控；CHO细胞表达体系和外源基因影响mRNA的翻译；表达细胞株的加压扩增，目的在于扩增外源基因的拷贝数，从而提高表达量；筛选表达细胞株，可获得稳定的、高表达的单克隆细胞株；大规模细胞培养中，血清、溶氧、二氧化碳、氨、乳酸的浓度以及剪切力影响细胞的生长、外源蛋白的表达和纯化。深入了解和灵活运用各种影响因素，有助于重组蛋白在CHO细胞中的高效表达。（一）CHO表达系统1.CHO细胞表达体系常用的CHO细胞系有两种：CHO和CHO-dhfr-。CHO表达系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一，与其它表达系统相比，它具有许多优点：准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子；表达产物胞外分泌，便于分离纯化；具有重组基因的高效扩增和表达能力；贴壁生长，有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可进行悬浮培养或在无血清培养基中达到高密度，培养体积能达到1000L以上；CHO细胞属于成纤维细胞，很少分泌内源蛋白，利于外源蛋白的分离纯化。改造CHO细胞，可更好地表达外源蛋白。为减少大规模细胞培养过程中凋亡的发生，将bcl-2基因（细胞凋亡抑制基因）导入细胞，bcl-2基因的过量表达能抑制Gln或氧缺乏引起的细胞凋亡，减少细胞特定营养成分的消耗，提高细胞密度和目的蛋白产量。向CHO细胞中导入p21、p27基因，可使细胞G1期延长（细胞静止），改造后细胞活力正常，营养成分消耗和代谢毒物含量有效降低，从而减少细胞凋亡、死亡，外源蛋白表达量提高，产品成本降低。2.载体系统借助真核基因表达调控的理论，可将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，使其方便高效地表达外源基因。目前，已经构建了许多真核表达载体，它们包含适当的顺式作用元件和选择标记。顺式作用元件主要有启动子—增强子元件、转录剪切和PolyA信号等；CHO细胞表达载体中主要有两类选择标记：非扩增基因和共扩增基因。2.1启动子和增强子启动子是影响外源基因表达效率的关键因素。作为表达载体元件之一，启动子既需强的转录活性，又应具备较广的应用范围。细菌的主要启动子和增强子在动物细胞中不起作用，所以大多从启动效率高且生物背景清楚的病毒基因组中分离得到。SV40、LTR和CMV启动子在CHO细胞中效果良好。有研究表明：在CHO细胞中，CMV启动子的转录活性分别是SV40启动子和LTR启动子的10倍和30倍左右。来源于噬菌体的一些启动子，如T7启动子也可用于动物细胞。除了病毒来源的启动子，现在热衷于寻找细胞内源性的启动子，如肽链无延长因子基因的启动子（EF-1α）、鸡胞浆β肌动蛋白启动子等。EF-1α启动子是迄今应用中最强的启动子之一。目前商业化的表达载体中主要使用SV40、CMV和EF-1α启动子。外源基因在哺乳动物细胞中的表达受许多因素的影响，如转录水平、转录后处理、翻译水平以及翻译后加工等方面，其中尤以转录水平的调节最为重要。在...