四川大学实验报告1 / 7题目：秀丽线虫生殖细胞凋亡检测一． 实验目的 : 1.掌握检测凋亡细胞的方法2.学习使用荧光染料活体染色的方法和步骤二． 实验原理1. 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）：是一种无毒无害、可以独立生存的线虫。其个体小，成体仅1.5mm 长，为雌雄同体（hermaphrodites），雄性个体仅占群体的0.2%，可自体受精或双性生殖；在20℃下平均生活史为3.5 天，平均繁殖力为300-350个；但若与雄虫交配，可产生多达1400 个以上的后代。1976 年，Sulston 和 Horvitz利用秀丽隐杆线虫 （Caenorhabditis elegans ）研究发现， 其约 13%的体细胞在胚胎发育中注定死亡，使得人们认识到细胞凋亡的遗传基础。2. 荧光染料活体染色：本实验使用吖啶橙（Acridine orange）作为染色剂， 该染料对细胞具有慢性毒性，致癌性强， 由于凋亡细胞因DNA片段化可结合更多染料，荧光显微镜下呈亮绿色，可在荧光显微镜下快速方便的检测出，适用于多数品系。三． 实验材料及设备四川大学实验报告2 / 71.实验材料：a) 各品系秀丽隐杆线虫： N2（实验组） , ced-1::gfp （方法对照组），ced-3（阴性对照）b) OP50 c) M9培养基d) NGM培养基2.实验设备：a) 普通光学显微镜b) 载玻片若干，盖玻片若干，铂金丝c) 暗箱d) 吸水纸、滴管等e) 荧光显微镜四． 实验方法及步骤1. 线虫接种、同步化2. 取样 ：在 12 孔板培养板上，每孔吸取900μ L 预先接入少量OP50的 M9培养基，每孔用铂金丝挑取培养20~30 条成体线虫3. 染色 ：向 N2与 ced-3 品系中每孔加入250μ g/mL 吖啶橙 100μ L,混匀后置于培养箱（避光）染色45~60min。4. 方法对照组观察：向 ced-1::GFP品系中加入1 滴盐酸左旋咪唑，麻痹线虫后在荧光显微镜下观察。四川大学实验报告3 / 75. 恢复 ：将已染色的线虫吸出置于35mm培养基中， 恢复 45~60min，使摄入的含染料的OP50排出。麻痹线虫并置于荧光显微镜下观察。6. 观察：上述三个品系用相同方法观察：蓝光激发，在 20 倍物镜中，凋亡细胞位于生殖腺臂弯转弯附近，呈亮黄色 （染色时间长） 或亮橙色（染色时间短） （ced-1::GFP 组凋亡细胞呈亮绿色 ），未凋亡细胞核为均匀的暗绿色。五． 实验结果（一） 方法对照组：图 1 方法对照组荧光显微镜观察结果在方法对照组中可观察到GFP蛋白标记的凋亡细胞的阳性结果：在生殖腺臂弯转弯附近有亮绿色的空泡，外沿颜色最深， 内...
