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城乡对口支援临床检验技术标准制定及培训ProgramofUrbanandRuralCounterpartSupportonClinicalLaboratoryTechnologyStandardDevelopmentandTrainingELISA检测技术要点与常见问题内容ELISA的概念•ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA）。基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。抗原抗体反应可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab],Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。特异性抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。最适比例敏感性化学比色法的敏感度为mg/ml水平酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。常见问题白板花板均板灰区竞争法ELISA检验方法相关项目ELISA常见类型一般情况下的双抗一般情况下的双抗体夹心法体夹心法ELISAELISA反反应应抗原过量时抗原过量时一步法一步法ELISAELISA反应反应会出现钩状效应会出现钩状效应钩状效应（钩状效应（hookeffecthookeffect））抗原的纯度对间抗原的纯度对间接法测抗体的影接法测抗体的影响响正常血清中所含的正常血清中所含的高浓度的非特异性高浓度的非特异性抗体对间接法的影抗体对间接法的影响响间接法的影响因素正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体对间接法的影响小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点抗原的固相化既可以直接进行，亦可以通过相应特异抗体而间接固相化抗原的固相化既可以直接进行，亦可以通过相应特异抗体而间接固相化酶及底物酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐橘红色黄色棕色兰色蓝绿色492450449425642碱性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色红色400500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色深蓝色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光黄色360,450420对照设定阳性对照品阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。阴性对照品阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。ELISA操作中的注意事项标本采集、保存试剂准备加样加样保温洗板显色比色结果判定酶标仪是垂直光路测定吸光度。垂直光的特点是样本吸光度受液体浓缩或稀释的影响小，不足之处是易受被测样本液面是否水平，酶标板透光性孔底是否平整等的影响较大。酶标仪在用单波长测定吸光度时，受到测定干扰（样本的浊度、干扰色等）、电路干扰（包括噪音、漂移、电压等）和液体表面张力的影响也很大。酶标仪单、双波长检测的比较结果的解释HIV和TP阳性结果的处理流程TP阳性s/co大于0.23，只能报可疑阳性同时需加做TPPA实验。TPPA实验阳性，进一步确定阳性报告。TPPA实验阴性，有待分析。谢谢！谢谢！