综合试验步骤汇总

RNA 提取及逆转录步骤组织 RNA 提取：1、将标本约 100mg 放入研钵，立即加入液氮，研碎后，立即加入TRIZOL 1mL，研磨 10min(清亮)后，转入 1.5ml EP 管，上下颠倒 10 次，室温静置5min。标本为组织时，12000 转离心 10min 取上清，转下步。2、每加入 1ml TRIZOL 在 EP 管中加入氯仿 0.2mL，震荡 15s 后，静置 5min，然后 12000 转离心 15min。3、将上层水相移入另一EP 管中（宁缺毋滥），并加入约 0.5mL 异丙醇，震荡混匀后静置 5min，12000 转离心 10min. 4、弃上清加 1mL 75%DEPC 乙醇（ -20 °C 预冷），漂浮 RNA 沉淀，（脾脏需用 Tip 吹打以去尽杂质），以 7500 转离心 5min。5、弃上清，置于工作台开风机干燥30min，待 RNA 沉淀变成半透明时，加入 DEPC 水 20uL/40uL，如果沉淀不溶解，置于55-60 度温箱水浴 5min左右。 -70 度保存或立即逆转录。静脉血 RNA 提取：1、将 5mL 静脉血于 EDTA 抗凝管中，放 4℃冰箱 2h 左右；2、3000 转离心 5min，吸取上清置于 1.5mL 离心管；3、加 4mL NS 于下层血细胞中，吹打混匀以悬浮细胞；4、加 4mL 大鼠淋巴细胞分离液到15mL 离心管中， 将血细胞悬液缓缓加到装有大鼠淋巴细胞分离液的离心管中；2000 转离心 25min；5、小心吸取云雾层（即单个核细胞） ，7500 转离心 5 分钟，去上清；6、以 1ml NS 重悬细胞，吹打洗涤，6500 转离心 5min，吸尽上清，存于 -80℃或加入 TRIZOL/ 裂解液。逆转录步骤 (MBI 试剂盒 )：1、05.mL EP 管中加入DEPC 水10uLRNA 1uL Oligo 1uL 置于 PCR 仪中 70℃ 5min （编号 XIER101 ）2、放入冰中 5min 3、点离 5 秒，加入5×缓冲液4uL Rnase抑制剂1uL dNTP 2uL 置于 PCR 仪中 37℃ 5min （编号 XIER102 ）4、加入逆转录酶 1uL，用 tip 头吹打混匀，放入PCR 仪中42℃60min，70℃10min（编号 XIER103 ），然后 -20℃保存。PCR 步骤（ 25uL 体系）：模板1uL Sense 1uL Anti-sense 1uL TaqMIX 12.5 uL 去离子水加至 25uL ★★ RNA浓度测定：取 1uL RNA原液稀释至 250uL，测定其 A260和A280的值，一般A260/280的比值在 1.8-2.0之间满足实验要求RNA 原液浓度 =A260×稀释倍数（ 250）×40（ng/μL）Western blotting一、主要试剂的配制 ( 所有单位均为 g/mL)1、丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺丙稀酰胺 29g+甲叉双丙稀酰胺1...