分子生物学实验

实验一感受态细胞制备（4 学时）一、实验目的：通过本实验，把握大肠杆菌感受态细胞制备的方式和技术。二、实验原理：细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态称感受态。其原理是细菌处于0°C、CaCl 的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。2三、仪器、材料和试剂（一）仪器：1.超净工作台 2.离心机 3.恒温摇床 4.高压灭菌锅 5.移液枪 6.振荡器7.天平 8.恒温水浴 9.离心管 10.锥形瓶（二）材料：大肠杆菌 DH5a（三）试剂：1.lCaCl 溶液 2.LB 液体培育基％酒精2四、实验步骤1•从大肠杆菌 DH5a 平板上挑取一个单菌落接于 3mlLB 液体培育基的试管中，37C 震荡培育留宿。2•取 1ml 菌夜转接到一个含有 50mlLB 液体培育基的锥形瓶中，37C 震荡培育 2-3h（现在，A 应在之间，细胞数务必＜108/ml,此为实验成功的关键）。6003•用移液枪取 2ml 菌液转移到离心管中，冰上放置 10min。（1000M 的枪，蓝色枪头，旋转不要太快，不能超过量程，每组至少做 6 管）4.离心 10min（4000r/min）。（离心机，严禁空转和不平稳，利用之前用太平平稳，对称放。上离心机之前，用卫生纸擦离心管。不要贴标签。用记号笔标记就能够够。盖紧离心管口。盖好离心机内盖）5•倒出培育液，将管倒置 1min,以使培育液流尽。（在超净工作台中操作）6•用冰凉的 lCaCl200M 悬浮沉淀（用振荡器），当即放在冰上保温 30min。2（200M 的枪，黄色枪头）7•低温离心 10min（4000r/min），回收细胞。8.用冰凉的 lCaCl200M 悬浮细胞（用振荡器）。29•分装细胞，毎 200ul—份，此细胞为感受态细胞。五、实验结果：有白色细胞细胞沉淀显现，该白色沉淀即为大肠杆菌感受态细胞。六、分析讨论：1.什么缘故实验步骤中 A 应在之间，细胞数务必＜108/ml?6002•步骤 6 和 8 中都加入了 CaCl 目的一样吗？它们的作用别离是什么？23.本实验的注意事项有哪些？实验二阳性克隆的挑选与鉴定、质粒 DNA 的提取(5 学时)一、实验目的：通过本实验学习和把握碱裂解法提取质粒的技术和克隆载体的挑选与鉴定方式。二、实验原理：一、蓝白斑挑选原理二、碱裂解法提取质粒是依照共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体 DNA 之间在拓扑学上的不同而达到分离目的。三、仪器、材料、试剂(一) 仪器：一、恒温摇床二、台式离心机 3、高压灭菌锅 4、振荡器(二) 材料：一、含 PUC-18 质粒的大肠杆菌二、乙二胺四乙酸(EDTA)3、三羟甲基氨基甲烷(Tris)4.葡萄糖 5•氢氧...