试验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质VIP专享

实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质一、实验目的1 掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。2 了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。二、实验原理马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。多酚氧化酶 (polyphenoloxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等．是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。植物受到机械损伤和病菌侵染后， PPO催化酚与 O2 氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH 条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410nm 处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计 410nm 处使反应体系的OD 值产生变化，通过OD 值的变化确定 PPO 的酶活大小。多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）＋ 1∕2O2——————→邻醌＋ H2O 三、试验材料、试剂及试验用品1．材料：马铃薯块茎。2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶3．试剂： 0.1mmol/L 磷酸缓冲液（pH=7.0）；0.01mol/L 邻苯二酚； 0.1mol/L 磷酸氢二钠； 0.1mol/L磷酸二氢钠； 10mmol/L 柠檬酸； 10mmol/L 抗坏血酸； 10mmol/L 乙二胺四乙酸二钠（ EDTA ）；10mmol/L 亚硫酸钠四、实验方法：1.多酚氧化酶的提取取 0.5g 马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（pH7.0）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用 7mL 磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。2.多酚氧化酶活性测定采用比色法测定。将0.5ｍl 邻苯二酚加入 2ｍl 磷酸缓冲液（ｐＨ 7.0）中，加入 0.5ｍl 酶提取液，立即于波长410nm 下测定吸光值， 2min 后再计吸光值，以不加酶提取液的反应液做对照(注意空白为： 2.5ml 缓冲液和 0.5mL 邻苯二酚溶液 )。以每分钟吸光度变化0.01 为 1 个多酚氧化酶活性单位。表 1 ...