实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶(PPO)活性测定及酶学性质一、实验目的1 掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。2 了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。二、实验原理马铃薯不耐储藏,在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变,使外观品质和营养价值大为降低,制约着马铃薯的开发利用。酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。多酚氧化酶 (polyphenoloxidase,PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等.是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶.普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。植物受到机械损伤和病菌侵染后, PPO催化酚与 O2 氧化形成醌,使组织形成褐变.以便损伤恢复,防止或减少感染,提高抗病能力。研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。因此,检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶,在一定的温度、pH 条件下,有氧存在时,能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质,单位时间内有色物质在410nm 处的吸光度与酶活性强弱成正相关,在分光光度计 410nm 处使反应体系的OD 值产生变化,通过OD 值的变化确定 PPO 的酶活大小。多酚氧化酶邻苯二酚(儿茶酚)+ 1∕2O2——————→邻醌+ H2O 三、试验材料、试剂及试验用品1.材料:马铃薯块茎。2.仪器:分光光度计;离心机;恒温水浴;研钵;试管;移液管;容量瓶3.试剂: 0.1mmol/L 磷酸缓冲液(pH=7.0);0.01mol/L 邻苯二酚; 0.1mol/L 磷酸氢二钠; 0.1mol/L磷酸二氢钠; 10mmol/L 柠檬酸; 10mmol/L 抗坏血酸; 10mmol/L 乙二胺四乙酸二钠( EDTA );10mmol/L 亚硫酸钠四、实验方法:1.多酚氧化酶的提取取 0.5g 马铃薯块茎样品,加入预冷的磷酸缓冲液(pH7.0)3ml,研磨匀浆,转移到离心管中,再用 7mL 磷酸缓冲液冲洗研钵,合并提取液,在4℃下离心(8000r/min)5min,取上清液为多酚氧化酶提取液,并量取粗酶液体积。2.多酚氧化酶活性测定采用比色法测定。将0.5ml 邻苯二酚加入 2ml 磷酸缓冲液(pH 7.0)中,加入 0.5ml 酶提取液,立即于波长410nm 下测定吸光值, 2min 后再计吸光值,以不加酶提取液的反应液做对照(注意空白为: 2.5ml 缓冲液和 0.5mL 邻苯二酚溶液 )。以每分钟吸光度变化0.01 为 1 个多酚氧化酶活性单位。表 1 ...