大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA 的转化一、实验目的和要求通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术。了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。二、实验原理感受态细胞 (Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。转化（ transformation）：是将异源 DNA分子引入一细胞株系， 使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。进入细胞的 DNA分子通过复制表达， 才能实现遗传信息的转移， 使受体细胞出现新的遗传性状。 转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。转化的方法：化学的方法 : 使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过处理将载体 DNA分子导入受体细胞；电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体 DNA分子导入受体细胞。克隆的筛选：主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源 DNA分子的受体细胞。 否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上， 会出现成千上万的细菌菌落， 将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。三、操作步骤1）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2 法) （1）从 E.coli DH5α 菌平板上挑取一单菌落，接种于3ml LB 液体培养基中， 37℃振荡培养过夜。将该菌悬液以1:100 ～1:50 转接于 200ml LB 液体培养基中， 37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min 测一次OD600nm，至 OD600nm≤0.5 时停止培养（约 2－3 小时）；（2）每人取 1 个离心管，转入1ml 培养液，在冰上冷却2-3min ，于 4℃，5000rpm／min 离心 5min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；（3）吸干上清培养液，用0.5 ml 冰冷的 0.1 M CaCl2 溶液轻轻悬浮细胞，，冰浴 15 min ；（4）5000rpm／min 离心 5min；（6）弃去上清液，加入100μ l冰冷的 0.1 M CaCl2 溶液，小心悬浮细胞，冰上放置超过 1 小时后，即制成了感受态细胞悬液；（7）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化...
