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RTPCR TPCR - RT-PCR 简介 反转录·聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）是将RNA 的反转录（reverse transcription ）和cDNA 的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA 合成 cDNA， 再以cDNA 为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR 技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA 病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA 序列。作为模板的RNA 可以是总RNA、 mRNA 或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA 中无RNA 酶和基因组 DNA 的污染。 RTPCR - 原理 只要是利用相关技术提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA 作为模板，采用Oligo（ dT）或随机引物利用反转录酶反转录成cDNA。再以cDNA 为模板经行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。 RTPCR - 过程 RT-PCR 可以用一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR 中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA 的合成首先在反转录缓冲液中进行，然后取出1/10 的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR 中，在同时为反转录和PCR 优化的条件下，反转录和PCR 在一直观众顺次进行。 1、反转录酶的选择 两种方法 1、 Money 鼠白血病病毒反转录酶 有较强的聚合酶活性，RNA 酶 H 活性相对较弱。最适作用温度为37°。 2、 AMV 反转录酶 有强的聚合酶活性和RNA 酶 H 活性。最适温度为42°。 2、合成cDNA 引物的选择 用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。 一步法 RT-PCR 引物的选择： 1. 随机引物 适用于长的或具有发卡结构的RNA。 适用于rRNA、 mRNA、 tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR 反应。 两步法 2. Oligo dT 适用于具有PolyA 尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA 和 tRNA 不具有PolyA 尾巴。）由于Oligo dT 要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA 样品的质量要求较高，即使有少量降解也 会使全长cDNA 合成量大大减少。 3. 基因特异性引物 与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。 RTPCR - 影响因素 RT-PCR 反应受多个因素影响，如硫酸镁的浓度, 引物退火的温度，扩增的循环数等。 1、建议选择0.5-3.0 mM (相差0.5 mM)的硫酸镁作初步实验。 2、 对于具有...