单克隆抗体的制备技术和纯化及鉴定一、实验目的:单克隆抗体制备是细胞免疫学的一个重要里程碑,它涵盖了细胞培养、细胞融合、免疫动物和抗体效价检测等各个方面内容。了解单克隆抗体制备的原理、主要步骤和方法。二、实验原理:骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖,但不能分泌特异性抗体;而抗原免疫的 B 淋巴细胞能产生特异性抗体,但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞,继承了两个亲代细胞的特性,既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性,又具有免疫B 细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在HAT 培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养,未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡;未融合的骨髓瘤细胞合成 DNA 的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断,又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶(HGPRT),不能利用培养基中的次黄嘌呤完成 DNA 的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶,因此能在 HAT培养基中存活和增殖。经过克隆选择,可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,在体内或体外培养,即可无限制地大量制备单克隆抗体。三、试剂与器材:细胞培养板、解剖器械、平皿、酶标仪、加样器、细胞计数板、CO2 培养箱、倒置显微镜等。四、操作方法:1、抗原制备;一般而言,抗原的纯度不很重要,特别是免疫原性较强的抗原。A.可溶性抗原(蛋白质)以 1mg/ml~5mg/ml 的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化,分多点小鼠皮下注射,总量为0.3ml~0.6ml,间隔3~5周再同样注射一次,10天后,断尾取血一滴,测抗体效价,选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉(尾静脉)给予无佐剂抗原 0.2ml~0.4ml,3~4天后,杀死小鼠取脾做融合用。B. 颗粒性抗原如抗原来源方便,可以不加佐剂而增加免疫次数,缩短间隔时间。例如用羊红血球免疫小白鼠,以1%浓度每只皮下注射0.2ml,每周2次,共免疫5~8次,取脾前3天,再免疫一次即可。有人认为最后一次免疫剂量要大,大到近于免疫耐受的程度更好。2、免疫动物;目前应用最广的是小白鼠和大白鼠,尤以小白鼠为好。就品系而言以 Balb/c 小白鼠应用最广,因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从 Balb/c 小白鼠系诱导出来。Balb/c 系小白鼠必须用纯系的,雌雄均可,以 8~12 周龄为宜。大白鼠也可,能产生较多量的单克隆抗体。现在已经在小鼠杂交瘤的基础上,...