第六章重组基因导入受体细胞讲解VIP免费

第五章重组基因导入受体细胞第一节受体细胞受体细胞(receptorcell)又称为宿主细胞或寄主细胞(hostcell)等，从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。作为基因工程的宿主细胞必须具备以下特性：①便于重组DNA分子的导入；②能使重组DNA分子稳定存在于细胞中；③便于重组体的筛选；④遗传性稳定高，易于扩大培养或发酵生长；⑤安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染；⑥有利于外源基因蛋白表达产物在细胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达。⑦在遗传密码的应用上无明显偏倚性；⑧具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达；⑨在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。关于细菌的感受态本质与存在•局部原生质体化假说——细菌表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过质膜进入细胞。•酶受体假说——感受态细胞表面形成一种能接受DNA的酶切位点，使DNA分子能进入细胞。通常制备高效转化的感受态细胞的方法是：在冰浴中，用一定浓度的CaCl2处理对数生长期的细菌。CaCl2处理后的细菌一般4℃可保存48h,用于转化，大多数能在1-2天内具有吸收外源DNA的能力。重组体分子导入受体细胞的途径将外源重组体分子导入受体细胞的途包括转化、转染、转导、显微注射、电穿孔等多种方式。这些途径将随载体种类和受体系统的不同而异。转化和转导主要适应于细菌一类的原核细胞和酵母这样的低等真核细胞，而显微注射和电穿孔主要应用于高等动植物的真核细胞。把带有目的基因的重组质粒DNA引入受体细胞的过程称为转化（transformation）。将重组噬菌体DNA直接引入受体细胞的过程称为转染（transfection）。若重组噬菌体DNA被包装到噬菌体头部成为有感染力的噬菌体颗粒，再以此噬菌体为运载体，将头部重组DNA导入受体细胞中，这一过程称为转导（transduction）。转化反应DNA分子转化的过程如下：1.吸附——完整的双链DNA分子吸附在受体菌的表面；2.转化——双链DNA分子解链，单链DNA进入受体菌，另一链降解；3.自稳——外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA；4.表达——供体基因随同复制子同时复制，并被转录、翻译。有的实验结果表明，进行转化的是双链DNA，有的则证明吸附在细胞表面的是双链DNA,但是以单链DNA进入细胞。至于质粒DNA转化质粒构型的关系，认为只有闭环DNA与开环DNA的转化，才能获得转化子，而线性质粒DNA进行转化不能得到转化子，因为用超螺旋闭合环状和开环质粒转化大肠杆菌不会受到菌体酶的破坏。基因工程中常用的受体细胞类型：•原核生物细胞•真核生物细胞–真菌细胞–植物细胞–动物细胞一、原核生物细胞优点：1.大部分原核生物细胞无纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入。2.没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。3.原核生物多为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。4.基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。缺点：1.原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统，即使真核生物基因能得到表达，得到的多是无特异性空间结构的多肽链。2.原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用。3.原核细胞内源性蛋白酶易降解异源蛋白，造成表达产物不稳定。至今被用作受体菌的原核生物有大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌等。(一)大肠杆菌受体细胞•大肠杆菌属革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。•优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制。•缺点：大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素，可导致人体热原反应。(二)枯草杆菌受体细胞•枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌。•优点：1.枯草杆菌具有胞外酶分泌－调节基因，能将具有表达的产物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表达产物...