摘自丁香园：跟大家分享一下小分子蛋白的 western-blot 相关注意事项以及操作技巧：我搞得蛋白质是一个 11KD 的分泌性蛋白，并且是我实验设计中一个重要的指标，最初学习 WB 技术，受困于二抗不合格一直连内参都做不出来。。。后面改换抗体之后，才相对顺利一点，其他指标也相继出来了。所以抗体真的很重要。但是在做 WB 实验的 7、8 个月过程中，我的核心的一个蛋白一直处于混沌状态，可能跑 30 次能现身一次，现身之后又没影好几个月，就这样捉摸不定，搞得我很烦，但又无可奈何。询问了实验室的同学们，说法各一：1、有人说小分子量蛋白就是难跑，为什么难大家也说不清楚。2、有的说分泌性蛋白本身胞内含量少，不好跑，需要加大上样量，似乎也是实话。3、还有的说小分子量蛋白容易降解，你的蛋白质降解了吧，我姑且信了。但是 95%的时候我跑出的条带都是大白板，纵然我通过 PCR、细胞的免疫荧光都能够发现这个蛋白，但是就是 WB 做不出来，4、也有朋友告诉我说分泌型蛋白你还是做 ELISA 吧，可是一来这个蛋白的 ELISA 试剂盒好贵的，二来我就是想做 WB。。。。所以就开始了上下求索之路。95%的时间跑出来的条带是这样的。。。这一求索就是几个月的时间。期间一直觉得电泳没什么技术含量，电转的过程才是重点，于是纠结于电转条件；也纠结过电转液的配置等。就在最近，再次翻阅论坛里面大神的回帖，其中一个大神提到：小分子量蛋白容易在电泳过程中弥散，电泳在压缩胶里多压一会，在分离胶里面跑一半就好了。对这个话百思不得其解，于是开始查询一些实验技术方面的文献，其中有几篇文献对我很有启发，其中有些技术原理方面的内容如下：在含 SDS 缓冲液的样品中，小分子多肽的浓缩是较困难的，因为小分子多肽与SDS 形成的复合体具有与 SDS 本身类似的电荷和大小，所以偏离了相对迁移率和分子质量对数的相互关系，因此浓缩对于小分子多肽的 SDS-PAGE 来说就成了一个突出问题。于是回去翻了翻自己曾经偶然跑出来的条带的模样，给我的感觉就是压缩的不好，然后还有弥散的现象（就是那种蛋白晕开的模样，例如这条带下面的波浪边缘，当然也可能是胶不均匀的原因吧，反正我当时就觉得是弥散的现象）然后我就突然有种恍然大悟的感觉，也许说的不对，但是我个人的感觉是：一般较大的分子量的蛋白（如 20-70KD）与上样缓冲液中的 SDS 结合后，因为本身蛋白分子大，SDS 附着在上面之后，还是和胶里面的 SDS 成分有较大差...
