G418筛选稳定表达细胞系经验总结VIP专享

G418 筛选稳定表达细胞系经验总结 我做了稳定转染，从G418 浓度确定到最后的单克隆化鉴定。有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。 筛选之前确定G418 浓度： 1、由于每种细胞对G418 的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418 有效成分的比重不同，一般1g 的粉剂中有效的G418 含量大约为0.722g。 2、G418 是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418 对细菌和真核细胞都起作用。neo 就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418 有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。 3、汇合度对G418 筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50% 4，G418 的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418 的最佳 筛选浓度。具 体如下 ：将 细胞稀 释 到1000 个 细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml 的G418 浓度范 围 内 进行筛选，选择 出 在10~14 天 内 使 细胞全 部 死亡 的最低G418 浓度来 进行下 一步 的筛选试 验。一个具 体试 验：3x106个 细胞电 转后，分别 接 种1/4000，1/1000，1/300 细胞到24 孔 板 中，48h 后加药 筛选，此 时1/300 细胞孔 内 大约50%汇合度。理 论 上1/4000 孔 内 应 有4%的汇合度。筛选9 天 后，观 察1/4000 孔 内 有两三 个 克隆，按 比例1/300 孔 内 应 该 有几 十 个克隆，事 实 上，它们 几 乎 全 死光 了，只 有几 个 克隆。 加药 时间 和维 持 浓度 1，由于基因转染到细胞内 之后要一段 时间 才 能表达出 蛋白质。所以筛选不能太 早 ； 但是也不能太 晚 ，因为转染了外 源 基因的细胞代 谢 负 荷 较大，增 值 较慢 ，时间 长 了就会被没有外 源 基因转入 的细胞所淹 没，最终 导 致 筛选不出 阳 性克隆，一般要在转染24 小 时之后才 开 始 加G418 筛选。随 着 细胞的代 谢 G418 的浓度和活性都会下 降 ，所以每3~5 天都要更 换 一次 含有G418 的筛选液 。这 时药 物浓度可以降 至200ug/ml。 2，加抗生素的时机 ，主要是考 虑 插 入 到细胞基因组 的抗性基因是否 已 经得 到表达。一般是转染48 小 时后加入 抗生素。挑 出 单克隆后...