动物的选择与免疫 1. 动物的选择:纯种 BALB/C 小鼠 2. 免疫方案:根据抗原的特性不同而定。 (1)可溶性抗原免疫原性较弱,一般要加佐剂,半抗原应先制备免疫原,再加佐剂。 初次免疫 抗原 1~50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射(一般 0.8~1ml,0.2ml/点) ↓3 周后 第二次免疫 剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或 ip(腹腔内注射)(ip 剂量不宜超过 0.5ml) ↓3 周后 第三次免疫 剂量同一,不加佐剂,ip(5~7 天后采血测其效价) ↓2~3 周 加强免疫,剂量 50~500μg为宜,ip 或 iv(静脉内注射) ↓3 天后 取脾融合 目前,用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新,如:①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平,增强免疫细胞对抗原的反应性。 细胞融合 (1) 主要试剂的配制 a、 细胞培养基 杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有 RPMI-1640 或 DMEM(Dulberco Modified Eagles Medium)两种基础培养基,具体配制方法按厂家规定的程序,配好后过滤除菌(0.22um),分装,4℃保存。 b、 氨基喋呤(A)贮存液(100×,4×10-5mol/L) : 称取 1.76mg 氨基喋呤(Aminopterin MW 440.4),溶于 90ml 超纯水或四蒸水中,滴加 1mol/L NaOH 0.5ml 中和,再补加超纯水或四蒸水至 100ml。过滤除菌,分装小瓶(2ml/瓶),-20℃保存。 c、 次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)贮存液(100×,H:10-2mol/L,T:1.6×10-3mol/L): 称取 136.1mg 次黄嘌呤(Hypoxanthine,MW 136.1)和 38.8mg 胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW 242.2),加超纯水或四蒸水至 100ml,置 45-50℃水浴中使完全溶解,过滤除菌,分装小瓶(2ml/瓶),-20℃冻存。用前可置 37℃加温助溶。 d、 L-谷氨酰胺(L.G.)溶液(100×,0.2mol/L) : 称取 2.92g L-谷氨酰胺(L-glutamine,MW 146.15),用 100ml 不完全培养液或超纯水(或四蒸水)溶解,过滤除菌,分装小瓶(4-5ml/瓶),-20℃冻存。 e、 青、链霉素(双抗)溶液(100×): 取青霉素 G(钠盐)100 万单位和链霉素(硫酸盐)1g,溶于 100ml 灭菌超纯水或四蒸水中,分装小瓶(4-5ml/瓶),-20℃冻存。 f、 7.5% NaHCO3 溶液 : 称取分析纯 NaHCO3 7.5g,溶于 1...