原位杂交实验步骤

威斯腾生物 400-675-6758原位杂交实验步骤原位杂交组织（或细胞）化学（In situ Hybridization Histochemistry，ISHH）简称原位杂交（In Situ Hybridization），属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA 或RNA 为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA 杂交，DNA-RNA 杂交和RNA-RNA 杂交三类。根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。尽管同位素标记（如 35S，3H，32P 等）仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展（尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针），更引起科技工作者的极大兴趣。一、基本要求1. 组织取材：组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA 降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30 min 内固定。2. 固定目的是：（1）保持细胞结构；（2）最大限度地保持细胞内DNA 或RNA 的水平；（3）使探针易于进入细胞或组织。最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。3. 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：（1）稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理 10 min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织和细胞标本亦可用0.2 M HCl 处理 10 min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。威斯腾生物 400-675-6758（2）去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是 Triton X-100。注意：过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构，而且还会引起靶核酸的丢失。（3）蛋白酶处理：蛋白酶消化能使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探针对靶核酸的可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶 K（proteinase K），还有链霉蛋白酶（pronase）和胃蛋白酶（pepsin）等。4. 杂交缓冲液孵育：杂交前用不含探针的杂交缓冲液在杂交温度下孵育 2 hr，以阻断玻片和标本中可能与探...