双向电泳步骤标准操作VIP专享

双向电泳 sun1 细胞裂解（蛋白质提取） 一、试剂配置： PBS配方 氯化钠(MW 58.44) 130mM 8g 氯化钾(MW 74.5) 2.7mM 0.2g 十二水和磷酸氢二钠(MW 358) 10 mM3.63g 磷酸二氢钾(MW 136) 2 mM0.24g 加水至1L配好后进行高压灭菌。 Washing buffer（500mL）配方 Tris（MW 121.1） 10mM 0.605g 蔗糖（MW 342） 250mM 42.75g 加水溶解，用HCl调pH至7.0后用孔径为0.22µm 滤膜过滤 （使用1M盐酸略高于2750uL调pH） 裂解储液配方（细胞）： 尿素(MW 60.06) 7M 4.2g 硫脲(MW 76.12) 2M 1.52g CHAPS(MW614.89) 4%（W/V） 0.4g 加超纯水定容至10mL后经0.22µm 一次性滤膜过滤，过滤后分装成20 小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。 裂解储液配方（组织）： 尿素(MW 60.06)5M3g 硫脲(MW 76.12) 2M1.52g 双向电泳 sun2 CHAPS(MW614.89) 2% 0.2g Tris（MW 121.1）40mM 0.048g 加超纯水定容至10mL后经0.22µm 一次性滤膜过滤，过滤后分装成20 小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。 裂解液： 裂解液储液 100uL IPG buffer（pH可选） 2% 2uL Pi 2uL NucLease mix（100×） 1uL PMSF（100mM：20mg/mL） 1mM 1uL DTT（0.411g/mL） 40mM 1.5uL Pi：每片使用 200uL超纯水溶解后按 10 uL分装 考马斯亮蓝 G-250： 考马斯亮蓝 G-250 0.01% 100g 95%乙醇 4.7% 50ml H3PO4 8.5% 85g 将考马斯亮蓝 G-250溶于 50ml95%乙醇中，与用水溶解的100mlH3PO4混合后稀释至1000ml，之后使用滤纸过滤。 二、实验准备： 1、准备冰盒，细胞裂解过程均在冰盒内进行（4℃）； 2、准备 4℃离心机，开机降温，保证温度下降至4℃； 3、取出置于-20℃保存的试剂，需冰上融化，最后取出细胞样品。 双向电泳 sun3 三、样品制备： （一）细胞 细胞裂解准备： 1、 收集细胞，使用大于500g转速离心5min； 2、 弃去上清，使用washing buffer重悬细胞沉淀，震摇待细胞完全打散后，继续用大于500g转速离心5min； 3、 重复步骤2两次，并使用转速2000rpm离心5min，弃上清。细胞可置于-80冰箱保存数周，或使用裂解液裂解。 细胞裂解： 1、 配置裂解液：注意先不要加入DTT。临用前加入PMSF后，立即将细胞裂解液加入待裂解的细胞中。 2、 加入裂解液的细胞置于冰盒内，每隔5-7min取出，于漩涡振荡器上震摇数秒，并再次放于冰盒中，保证细胞裂解时的温度为4℃。 3、 裂解15-20min后...