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双向电泳步骤标准操作

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双向电泳 sun1 细胞裂解(蛋白质提取) 一、试剂配置: PBS配方 氯化钠(MW 58.44) 130mM 8g 氯化钾(MW 74.5) 2.7mM 0.2g 十二水和磷酸氢二钠(MW 358) 10 mM3.63g 磷酸二氢钾(MW 136) 2 mM0.24g 加水至1L配好后进行高压灭菌。 Washing buffer(500mL)配方 Tris(MW 121.1) 10mM 0.605g 蔗糖(MW 342) 250mM 42.75g 加水溶解,用HCl调pH至7.0后用孔径为0.22µm 滤膜过滤 (使用1M盐酸略高于2750uL调pH) 裂解储液配方(细胞): 尿素(MW 60.06) 7M 4.2g 硫脲(MW 76.12) 2M 1.52g CHAPS(MW614.89) 4%(W/V) 0.4g 加超纯水定容至10mL后经0.22µm 一次性滤膜过滤,过滤后分装成20 小管,每小管500uL,-20℃冰箱保存。 裂解储液配方(组织): 尿素(MW 60.06)5M3g 硫脲(MW 76.12) 2M1.52g 双向电泳 sun2 CHAPS(MW614.89) 2% 0.2g Tris(MW 121.1)40mM 0.048g 加超纯水定容至10mL后经0.22µm 一次性滤膜过滤,过滤后分装成20 小管,每小管500uL,-20℃冰箱保存。 裂解液: 裂解液储液 100uL IPG buffer(pH可选) 2% 2uL Pi 2uL NucLease mix(100×) 1uL PMSF(100mM:20mg/mL) 1mM 1uL DTT(0.411g/mL) 40mM 1.5uL Pi:每片使用 200uL超纯水溶解后按 10 uL分装 考马斯亮蓝 G-250: 考马斯亮蓝 G-250 0.01% 100g 95%乙醇 4.7% 50ml H3PO4 8.5% 85g 将考马斯亮蓝 G-250溶于 50ml95%乙醇中,与用水溶解的100mlH3PO4混合后稀释至1000ml,之后使用滤纸过滤。 二、实验准备: 1、准备冰盒,细胞裂解过程均在冰盒内进行(4℃); 2、准备 4℃离心机,开机降温,保证温度下降至4℃; 3、取出置于-20℃保存的试剂,需冰上融化,最后取出细胞样品。 双向电泳 sun3 三、样品制备: (一)细胞 细胞裂解准备: 1、 收集细胞,使用大于500g转速离心5min; 2、 弃去上清,使用washing buffer重悬细胞沉淀,震摇待细胞完全打散后,继续用大于500g转速离心5min; 3、 重复步骤2两次,并使用转速2000rpm离心5min,弃上清。细胞可置于-80冰箱保存数周,或使用裂解液裂解。 细胞裂解: 1、 配置裂解液:注意先不要加入DTT。临用前加入PMSF后,立即将细胞裂解液加入待裂解的细胞中。 2、 加入裂解液的细胞置于冰盒内,每隔5-7min取出,于漩涡振荡器上震摇数秒,并再次放于冰盒中,保证细胞裂解时的温度为4℃。 3、 裂解15-20min后...

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