余功臣分子克隆

分子克隆技术实验报告应用生物技术 08012024304202408余功臣实验是由小组成员集体完成，实验报告以及结果分析由个人完成。小组成员：余功臣、晏星、何一鸣、伍良伟。试验时间由 2024 年 5 月8 日至 5 月 14 日，共完成分子克隆、分子杂交和基因表达检测三大部分的实验。下列实验报告中的实验试剂具体成分以及配置方式均未列出，详见《分子克隆技术实验手册》附录。一．将 M812 载体上的水稻 DNA 片段亚克隆于 pUC19 载体上摘要运用碱裂解法抽提质粒载体 pUC19 和带有水稻目的 DNA 片段 M812 的质粒pU1301，用琼脂糖凝胶电泳检测所提取的质粒 DNA 的质量，用限制性内切酶BamI和 KpnI处理 pU1301 和 pUC19，将纯化的载体 pUC19 与回收的水稻 DNA 片段M812 连接后，将重组的 DNA 分子导入感受态细胞大肠杆菌菌株 DH5并在培育皿上培育。关键词碱裂法 琼脂糖凝胶电泳检测 亚克隆 感受态细胞 重组子的转化1 前言亚克隆，即是将已经获得的目的片段进行进一步分析，或者进行重组改造等过程。其基本过程包括：（1）目的片段和载体的制备；（2）目的片段和载体的连接；（3）连接产物的转化；（4）重组子筛选。本实验中的目的片段和载体均来自细菌质粒，因此细菌质粒的抽提是目的片段和载体制备的核心步骤。本实验中以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。碱裂解法，是 1979 年由Birnboim 和 Doly 设计并发表的经典质粒 DNA 提取方法。其核心原理是在碱性条件下线状 DNA发生变性，质粒 DNA 维持环状。在高盐条件下作复性处理，变性的染色体会沉淀，从而将质粒 DNA 与染色体 DNA 分开。在 pH 值为－时，核酸分子带负电，在电泳时由负极向正极移动。采纳适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异。核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。所抽提的质粒即用电琼脂糖凝胶电泳来检测。一般所抽提的质粒在琼脂糖胶上能够呈现三条带，因为质粒有三种构型，即线状、环状、开环状。将所获得的载体质粒与带有目标片段的质粒进行重组，其包括载体及外源 DNA 片段的双酶切消化、目的片段的回收和载体的纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DNA 片段的克隆技术是分子操作的核心部分。将重...