实时荧光定量 PCR 一种科学准确的定量方法 实时荧光定量 PCR 技术于 1996 年由美国 Applied Biosy stems 公司推出，由于该技术不仅实现了 PCR 从定性到定量的飞跃，而且与常规 PCR 相比，它具有特异性更强、有效解决 PCR 污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。 一. 实时荧光定量 PCR 原理 所谓实时荧光定量 PCR 技术，是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义 在荧光定量 PCR 技术中，有一个很重要的概念 —— Ct 值。C 代表Cy cle，t 代表threshold，Ct 值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1 所示）。 图1. Ct 值的确定 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍，即：threshold = 10 ´ SDcy cle 6-15 3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2 所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 图2. 荧光定量标准曲线 4. 荧光化学 荧光定量PCR 所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料〔2〕。现将其原理简述如下： 1） TaqMan 荧光探针： PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq 酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步。如图3 所示。 图3. TaqMan 荧光探针工作原理 2）SY BR 荧光染料： 在 PCR 反应体系中，加入过量 SY BR 荧光染料，SY BR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SY BR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光...
