实时荧光定量PCR技术的原理及应用

实时荧光定量PCR 技术的原理及应用 在PCR 扩增反应结束之后，可对扩增产物进行定性和定量的分析。但是无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 扩增之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量PCR 技术应运而生。实时荧光定量PCR 技术于 1996 年由美国 Applied Biosy stems 公司推出，实现了 PCR 从定性到定量的飞跃。 1. 实时荧光定量PCR 技术的基本原理 在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。所谓实时荧光定量PCR 技术，是指通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数 。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。在扩增曲线中：荧光阈值(threshold)是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光阈值的缺省设置是 3～15 个循环的荧光本底信号(baseline)标准差的10 倍；Ct 值的含义是指在PCR 循环过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数,也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环次数；Rn+表示每点测量的荧光强度,代表反应管含有模板 DNA ;Rn-表示荧光基线强度,代表反应管不含有模板 DNA,其在理想情况下是一条平线,只具有背景荧光数值;Δ Rn 表示 PCR 过程中,探针降解的量,也即 PCR 产物的量；基线( baseline)是背景曲线的一段,范围为从反应开始不久荧光值开始变得稳定,到所有反应管的荧 1 光都将要但是还未超出背景。（如图1 所示） （图1） 1 .1 数学原理 PCR 扩增为指数扩增，...