实时荧光定量 PCR 方法简介 一． 实时荧光定量 PCR 的基本原理 理论上，PCR 过程是按照 2n（n 代表 PCR 循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。但在实际的 PCR 反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法（利用EB 染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经 PCR扩增、EB 染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。 为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量 PCR 采用新的参数——Ct 值，定量的根本原理是 Ct 值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。 Ct值是如何得到的 在实时荧光定量 PCR 的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量 PCR 仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的 Ct 值。 Ct值的定义 Ct 值中的“C”代表 Cy cle（循环），“t”代表检测 threshhold（阈值），其含义是 PCR 扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对应的横坐标。 Ct值与样品中模板的对应关系 Ct 值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y =ax +b，x 代表起始模板拷贝数的对数，y 代表Ct 值）。 与终点法相比利用Ct值的优势 由于Ct 值是反映实际PCR 反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct 值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR 扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB 等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。 下图中是96 个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到 Ct 值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到 300个单位。 此外，采用实时荧光定量PCR 还能从方法学上有效的防止 PCR 实验中交叉污染的问题。因为荧光定量PCR 中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果，直接丢弃含有大量扩增产物的反应管，彻底避免了传统方法中取出扩增产物进行电泳鉴定...
