实验十一__酶联免疫吸附测定

实验十一 酶联免疫吸附测定（ELISA ） 一、原理 酶联免疫吸附法(ELISA，enzyme-linked immunosorbent assay)是一种利用免疫学原理检测抗原或抗体的技术。它与经典的以同位素标记为基础的液—液抗原—抗体反应体系不同之处是建立了固—液抗原—抗体反应体系，并采用酶标记，抗体与抗原的结合通过酶反应来检测。由于酶反应的放大作用，使测定的灵敏度极高，可检出 1pa 的目的物；同时酶反应还具有很强的特异性。除了可溶性抗原(抗体)之外，ELISA 还可以检测含表面抗原的细胞。因此，ELISA 是基因表达研究中不可缺少的方法。通过表达蛋白的定量测定，可以研究外源基因在转基因植株中的表达活性、外源基因在转基因植株中表达的器官组织特异性和外源基因在转基因植物中的表达调控。 ELISA 检测程序包括抗体制备、抗体或抗原的包被、免疫反应及检出三个阶段，现将这三个阶段的有关原理及操作介绍如下： （一）抗体的制备 抗体是机体应抗原刺激产生的一组特殊的球蛋白，以Iｇ表示。无脊椎动物不产生免疫球蛋白；两栖类产生 IgM、IgG；家兔产生 IgM、IgG、IgA；人类出现 IgG、IgM、IgA、IgD、IgE，其中 IgG 是主要的，占总量的75％，分子量为160kDa。ELISA 检测中涉及到的抗体有两种，一种是未标记的抗体，另一种是酶标记的抗体。酶标记的抗体又有两种情况，第一种是针对特异抗原的酶标一抗，第二种是针对一抗的酶标二抗。酶标抗体制备包括通过免疫过程制备抗体及对所获的抗体进行酶标记两大步骤。 1．通过免疫反应制备抗体 1)抗原制剂的制备 要获得优质抗体，使用的抗原必须具有较强的免疫原性并应经过纯化。完全抗原具免疫原性(刺激机体产生一系列免疫反应)及反应原性(与抗体发生特异性反应)。如果只有反应原性而缺少免疫原性或免疫原性不完善，则称不完全抗原或半抗原。需要用半抗原进行免疫反应时，应将半抗原与一些免疫原性强的蛋白质，如 BSA、γ—球蛋白等(这些蛋白质称为载体蛋白)进行化学偶联，或通过戊二醛作用使二者交联形成多聚体，这样均可提高其免疫原性。免疫时，需将抗原制备成抗原制剂。制备抗原制剂常使用免疫佐剂。可溶性抗原经佐剂乳化后注射，佐剂—抗原的乳化物在动物机体内逐步释放，可延长抗原在机体内的存留时间，便于抗原在较长时间里不间断地刺激机体免疫系统，提高抗体效价。另外佐剂中含有激活巨噬细胞等生理活性的卡介苗类物质，可提高抗原的免疫原性。常用的佐剂是福氏佐剂，成分是1 份羊毛脂+5 ...