总结了测序中经常遇到的问题及原因分析，希望对大家有帮助！ Q:测序结果中为什么找不到引物序列? A:找不到用来测序的引物，这是正常的，因为测序的方法是荧光标记测序法，仪器通过检测 ddNTP 上的荧 光来读取所测序列，而引物本身是不被标记的，所以仪器无法检测到； 找不到所测片段的扩增引物，这种情况是因为您所采用的酶切位点离所用的测序引物距离太近，一般荧光 燃料会干扰几十个碱基的读取，这部分碱基会损失掉，损失掉的序列很可能就包含引物的序列，所以引物 的序列无法找到； 测出的引物序列是原引物序列的反向互补序列，这是因为 TA 克隆的插入没有方向性，如果插入片段是相 反的，这时就要反向互补查找引物； 测出的结果为空载体，这是因为由于某种原因导致质粒上没有插入外源片段，这时所测的为载体序列，所 以就找不到引物了； 存在单引物扩增，有一条引物的特异性不好，有多个结合位点，导致只有一条引物参与扩增。 Q:为什么测序结果中引物的序列有个别碱基不同了? A: 这是因为引物区同样存在错配的可能，出现这种可能性有两种: 合成错误和引物区有错配 我们可以挑选同批次 2个以上的克隆进行测序验证，如果结果完全相同，应该是合成错误；如果在引物的 相同位置错误的碱基不一样那就应该是引物区有错配。 Q:哪些引物不适合作为测序引物? A:①兼并引物：简并引物要在测序模板上有多个结合位点，直接影响测序结果； ②随机引物：如 RAPD 引物，随机引物一般都比较短，所用退火温度低，在测序反应的条件下，不能很好 地与模板结合； ③过长的引物：一般要求测序引物不大于 24bp，过长的引物在测序反应的较低的条件下容易在测序模板上 有多个结合位点，导致测序结果背景增高。另外，较长的引物纯度也将难以保证。通常用于测序的引物纯 度要在 90%以上，引物纯度低时，测序反应的背景将明显增大，直接影响到测序结果； ④有特殊标记的引物：该情况主要指荧光标记的引物。我们测序反应的四种碱基都是荧光标记的，这样， 荧光标记的引物将产生干扰。另外，其他一些有大的标记基团的引物也最好不要用于测序。引物上大的标 记基团将直接影响到 DNA 片段的迁移率，导致测序结果峰型不好或错误； ⑤不纯的引物：测序引物对纯度的要求很高，合成的引物中非全长的片段可以造成较强的背景。测序的引 物最好是经过 PAGE 胶纯化的。 Q: 用测序的方法检测点突变可靠吗？ A: 该方法可靠性不高，主要有...
