总结了测序中经常遇到的问题及原因分析,希望对大家有帮助! Q:测序结果中为什么找不到引物序列? A:找不到用来测序的引物,这是正常的,因为测序的方法是荧光标记测序法,仪器通过检测 ddNTP 上的荧 光来读取所测序列,而引物本身是不被标记的,所以仪器无法检测到; 找不到所测片段的扩增引物,这种情况是因为您所采用的酶切位点离所用的测序引物距离太近,一般荧光 燃料会干扰几十个碱基的读取,这部分碱基会损失掉,损失掉的序列很可能就包含引物的序列,所以引物 的序列无法找到; 测出的引物序列是原引物序列的反向互补序列,这是因为 TA 克隆的插入没有方向性,如果插入片段是相 反的,这时就要反向互补查找引物; 测出的结果为空载体,这是因为由于某种原因导致质粒上没有插入外源片段,这时所测的为载体序列,所 以就找不到引物了; 存在单引物扩增,有一条引物的特异性不好,有多个结合位点,导致只有一条引物参与扩增。 Q:为什么测序结果中引物的序列有个别碱基不同了? A: 这是因为引物区同样存在错配的可能,出现这种可能性有两种: 合成错误和引物区有错配 我们可以挑选同批次 2个以上的克隆进行测序验证,如果结果完全相同,应该是合成错误;如果在引物的 相同位置错误的碱基不一样那就应该是引物区有错配。 Q:哪些引物不适合作为测序引物? A:①兼并引物:简并引物要在测序模板上有多个结合位点,直接影响测序结果; ②随机引物:如 RAPD 引物,随机引物一般都比较短,所用退火温度低,在测序反应的条件下,不能很好 地与模板结合; ③过长的引物:一般要求测序引物不大于 24bp,过长的引物在测序反应的较低的条件下容易在测序模板上 有多个结合位点,导致测序结果背景增高。另外,较长的引物纯度也将难以保证。通常用于测序的引物纯 度要在 90%以上,引物纯度低时,测序反应的背景将明显增大,直接影响到测序结果; ④有特殊标记的引物:该情况主要指荧光标记的引物。我们测序反应的四种碱基都是荧光标记的,这样, 荧光标记的引物将产生干扰。另外,其他一些有大的标记基团的引物也最好不要用于测序。引物上大的标 记基团将直接影响到 DNA 片段的迁移率,导致测序结果峰型不好或错误; ⑤不纯的引物:测序引物对纯度的要求很高,合成的引物中非全长的片段可以造成较强的背景。测序的引 物最好是经过 PAGE 胶纯化的。 Q: 用测序的方法检测点突变可靠吗? A: 该方法可靠性不高,主要有...