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原核诱导表达汇总

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1原核诱导表达的标准操作程序(SOP)一.目的:使本实验室工作人员了解诱导表达的操作过程,并能实际动手进行原核诱导表达一系列实验。二.适用范围:本 SOP 适用于对新基因克隆的表达,并针对新基因产生的可溶性蛋白。三.实验原理:E.coli 的乳糖操纵子含 Z、Y 及 A 三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列 0、一个启动序列 P 及一个调节基因 IoI 基因编码一种阻遏蛋白,后者与 0 序列结合,使操纵子受阻遏而处于关闭状态。在启动序列 P 上游还有一个代谢物基因激活蛋白(CAP)结合位点。由 P 序列、0 序列和 CAP 结合位点共同构成 lac 操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时, lac操纵子处于阻遏状态。此时,I 序列在 PI 启动序列操纵下表达的 Lac 阻遏蛋白与 0 序列结合,阻碍 RNA 聚合酶与 P 序列结合,抑制转录起动。当有乳糖存在时,lac 操纵子即可被诱导。在这个操纵子体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经 b—半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与 0 序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。四、试剂准备:(一)实验器材的灭菌:枪头的灭菌:ImL,200 卩 L,20 卩 L 的枪头放入枪头盒,用报纸包住(2 层),放入高压灭菌锅中灭菌,121°C,20mino80°C 烘箱中烘干,常温放置。螺口管及离心管的灭菌:将螺口管和离心管分别放入铝制饭盒中(盖子要拧松,离心管的管盖打开),放入高压灭菌锅中灭菌,121°C,20mino80C 烘箱中烘干,常温放置。50mL 离心管的灭菌:将 50mL 离心管用报纸包住(2 层),放入高压灭菌锅中灭菌,121C,20mino80C 烘箱中烘干,常温放置。(二)LB 培养基的配制液体 LB 培养基(1L):蛋白胨 10g 氯化钠 10g酵母提取物 5g 调 PH 值到 7.5,高压灭菌,4°C 保存。固体 LB 培养基(1L):蛋白胨 10g 氯化钠 10g 酵母提取物 5g 琼脂粉 15g高压灭菌,不烫手的情况下加入抗性,抗性:培养基=1:1000(氨苄,卡那通常浓度),混匀。马上在无菌操作台中倒平板,并开大风吹干。用封口膜封住,倒置放于 4°C 保存。(三)IMIPTG 的配制:2经过计算,10gIPTG 可以配 42ml 的 IMIPT...

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