Calcein-AM和PI鉴别死活细胞

PI 可以用来进行活细胞、死细胞的双重染色钙黄绿素-AM(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)溶液，它们分别可对活细胞和死细胞染色。Calcein -AM 的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜。尽管 Calcein -AM 本身并不是荧光分子，但通过活细胞内的酯酶作用，Calcein -AM 能脱去 AM 基，产生的 Calcein 能发出强绿色荧光（激发：490 nm，发射：515 nm）。因此 Calcein - AM 仅对活细胞染色 。另一方面，作为核染色染料的 PI 不能穿过活细胞的细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的 DNA 双螺旋从而产生红色荧光（激发：535 nm，发射：617 nm）。由于 Calcein 和 PI-DNA 都可被 490 nm 激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用 545 nm 激发，仅可观察到死细胞。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，我们建议个别确定 PI 和Calcein -AM 的合适浓度。 I．试剂 Calcein-AM PI II．用荧光显微镜观察细胞形态 以 HeLa 细胞染色为例,请注意不同的细胞种类、不同浓度有不同的观察条件。根据细胞条件，摸索不同条件下的细胞贴壁情况和试剂浓度的配制等最佳条件。 １．染色溶液的配制 1）用 1 ml 无水 DMSO 溶解 1 mg Calcein-AM，制备成 1 mmol/l 的Calcein-AM 储备液，-20℃下密闭冷冻保存。 2）用 1 ml ddH2O 溶解 1 mg PI，制备成 1.5 mmol/l 的 PI 储备液（1 mg PI/1 ml H2O），-20℃下密闭冷冻保存。 3）将 Calcein-AM 储备液和 PI 储备液放置于室温。 4）加 10 μl Calcein-AM 储备液和 15μl PI 储备液至 5 ml PBS 中配制成染色溶液。 Calcein-AM 的终浓度为 2 μmol／l，PI 的终浓度为 4μmol／l。 2．细胞染色 1）染色 HeLa 细胞等贴壁细胞时,先用 Trypsin-EDTA 等消化细胞，制备成细胞悬液。 2）将细胞悬液离心 3 分钟(1,000 rpm)。 3）去除上清液，加入 PBS 缓冲液，细胞数量调整至 105 –106 个／ml。再用移液器充分混匀。 4）由于培养基中的血清等含有酯酶，Calcein-AM 遇水会分解，会导致空白上升，所以需要离心数次，用 PBS 洗涤数次直到完全洗净。 5）将 200 μl 细胞悬液移至小试管中，加入 100 μl 染色溶液，在37℃下孵育 15 分钟。 6）在盖玻片上滴加适量的染色的细胞溶液。 7）在荧光显微镜下，先使用 490±10 nm 波长激发，观察黄绿色的活细胞，还可以同时观察到红...