相对荧光定量PCR三种常用方法、注意事项

相 对 定 量 方 法 实 际 操 作 （ 三 种 常 用 方 法 ） 本 人 用 的 是 相 对 荧 光 定 量PCR 法 ， 在 分 子 水 平 上 比 较 课 题 中5种 新 基 因 的 表 达 差 异 。 实 验 进 行 很 多 次 ， 感 受 颇 深 ， 同 时 遇 到 了一 些 问 题 ： 扩 增 效 率 、标准品选择（ 及赋值）、标准曲线、重复性等问 题 ， 希望有同 行 朋友一 起探讨和指教。 1. Comparativ e Delta-delta Ct 法 定 量 流程（ RG6000 软件设置） 1 ). 先对样品中的目的基因与看家基因分别做标准曲线，通过标准曲线确定两个基因的扩增效率是否一致或接近；将扩增效率优化为一致。 2 ). 同一样品分别进行看家基因和目的基因的扩增，分列在两页中 公式： P1 P2 相同的样品在两页里命名成相同的名称，并定义为unknow n 分别分析 P1 和 P2 页 选 delta-delta Ct 选项 依次填入，并定义对照样品 完成分析 F=2— 待检样品看家基因平均Ct 值 对照组目的基因平均 Ct值 对照组看家基因平均Ct值 — 待检样品目的基因平均Ct 值 — — Comparativ e Delta-delta Ct 法 的 特 点 、注意事项及实际应用 1). Comparativ e Delta-delta Ct 法是很常用的一种相对定量方法，其最大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR 扩增即可。 2). 其缺点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。 3). Comparativ e Delta-delta Ct 法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene 的软件会自动给出两组标准曲线的R 值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M 值的差小于0.1，那么后续实验中就可以用Comparativ e Delta-delta Ct 法进行相对定量分析。反之，如果 M 差值大于 0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于 0.1，二是换用其它的相对定量方法。 应用实例： 如上图，将标准品进行梯度稀释后，分别对目的基因（Gene of Interest）和看家基因（Housekeeper Gene）做标准曲线。软件自动绘制标准曲线，并给出相应的参数。从上图可知，两组标准曲线的M 值分别为-3...