常用的单克隆抗体检测方法

常用的单克隆抗体检测方法 通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，在杂交瘤制备完成后，需要对抗体进行一个检测，本文介绍了几种常用的抗体检测的方法（1）免疫酶技术免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。①器材和试剂 a、包被缓冲液：碳酸盐缓冲液：取 0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml 混合，再加 75ml 蒸馏水，调 PH 至9.6。Tris-HCl 缓冲液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml 混合，加蒸馏水至 1000ml。b、洗涤缓冲液（PH7.2 的 PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸馏水至1000ml。c、稀释液和封闭液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗涤液至 100ml；或用洗涤液将小牛血清配成 5-10%使用。d、酶反应终止液（2mol/L H2SO4）：取蒸馏水 178.3ml，滴加浓硫酸（98%）21.7ml。e、底物缓冲液（PH5.0，磷酸盐-柠檬酸缓冲液）：取 0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L柠檬酸 24.3ml，再加 50ml 蒸馏水。柠檬酸溶液与配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。f、底物使用液：OPD 底物使用液（测 490nm 的 OD 值）：OPD 5mg，底物缓冲液 10ml，3% H2O2 0.15ml。TMBS 或 TMB 底物使用液（测 450nm 的 OD值）：TMBS 或 TMB（1mg/ml）1.0ml，底物缓冲液10ml，1% H2O2 25ul。ABTS 底物使用液（测 410nm的 OD 值）：ABTS 0.5mg，底物缓冲液 1ml，3% H2O2 2ul。g、抗体对比：以骨髓瘤细胞培育上清作为阴性对比，以免疫鼠血清作为阳性血清。h、抗原： 可溶性抗原：尽量纯化，以获得高特异性。病毒感染的传代细胞或全菌抗原。淋巴细胞等悬液。i、酶标抗鼠抗体或酶标 SPA 或其他类似试剂。j、 细胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg，KH2PO4 500mg，蒸馏水 150ml，丙酮 225ml，甲醛 125ml；或丙酮-甲醛溶液（1；1）；或-20℃甲醇。k、聚苯乙烯微孔板：40 孔、96 孔、或条孔；硬板或软板均可使用。l、酶联免疫阅读仪；或光镜。m、吸管、加样器与水浴箱、离心机等。②可溶性抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA）a、纯化抗原用包被液稀释至1-20ug/ml。b、以 50-100ul/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或 37℃吸附 2 小时。c、弃去孔的液体，同时用...