刘凤君实验步骤1.采血:抽取初治（初始抗病毒治疗）之前 CHB、CHC 患者外周静脉血 6ml,注入肝素抗凝管中，轻轻摇匀。2.稀释：室温下加入等体积的 PBS，轻轻吹打混匀。3.加样：取 50ml 离心管，吸取 6ml Ficoll（淋巴细胞分离液）于离心管中，(Ficoll 与稀释前血液的体积比为 1:1），管倾斜 45°，将稀释后的血液在 Ficoll 液面上方约 1cm 处沿管壁缓慢加至 Ficoll上面.4.离心：18-20℃,2000rpm，30min，离心后从管底至液面分四层,依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层。5.回收：将移液管直接插入云雾层（或者先吸去上层的血浆），轻轻吸出云雾层,放入新的离心管中.6.洗涤：加入至少于 PBMC（外周血单个核细胞）体积 3 倍的PBS，18—20℃,2000rpm，10min,两次.7.细胞计数:弃上清,加 1ml RPMI-1640 培育基（含 10%胎牛血清）,吹打混匀,制备成 PBMC 细胞悬液。① 专用仪器测定：吸取一定量的 PBMC 细胞悬液于 EP 管中,取等量 2%台盼蓝，吹打混匀后吸取 1 滴进行细胞浓度测定。② 血细胞计数板：取一滴 PBMC 悬液与一滴 2%台盼蓝染液混匀后加于血细胞计数板中，在显微镜下计数 4 大格内细胞总数。细胞数/ml=4 个大方格细胞总数/4×104×2（稀释倍数）8。细胞培育：细胞计数后调整细胞浓度为 2×105/ml 培育基，加于 6 孔板或 24 孔板中进行培育。（我们通常是培育过夜后再进行下一步处理）。9.干扰素处理：加入 500IU/ml（培育基的终浓度)的 α-IFN(干扰素），同时设对比组,时间为 8 小时。(家族性乙肝、丙肝患者中不准备抗病毒治疗者省去干扰素处理的步骤。10。细胞收集:将 6 孔板或 24 孔板中的培育基吸出弃掉，每孔加200ulTrizol，用移液枪将孔壁吹打数次后，将 Trizol 转入 EP 管中。11.细胞冻存：将收集的细胞放入—80℃冰箱中保存。
