紫杉醇作为一种高效、广谱的抗癌药物，它在内生真菌中的含量直接决定了该菌株的药用价值。HPLC法通常作为检测紫杉醇的基本方法，常用于定量分析紫杉醇含量。可根据保留时间判断是否含有紫杉醇和紫杉烷类代谢产物[4]。10-去乙酰紫杉醇（10-deacetylpaclitaxel，10-DAP）是理想的紫杉醇半合成前体，而7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇（7-Xylosyl-10-deacetylpaclitaxel，10-DAXP）可以转化为10-去乙酰紫杉醇。多烯紫杉醇（Docetaxel）是紫杉醇的衍生物，通过干扰细胞有丝分裂和分裂间期细胞功能所必须的微管网络而具有抗肿瘤作用。本章研究我们利用高效液相色谱技术（HPLC）对过表达枝霉MD2菌株A10182-MD2、A10251-MD2所含有的紫杉醇、及紫杉醇前体巴卡亭Ⅲ、10-去乙酰巴卡亭Ⅲ、7-木糖基-10-去乙酰紫杉醇、10-去乙酰紫杉醇、多烯紫杉醇的含量进行检测，考察这些成分在过表达MD2菌株中的含量情况及对照野生型MD2菌株的变化，为后期的实验提供基础。PDL、PDA培养基的配方同第三章。表仪器概览仪器名称生产厂家安捷伦1200Series高效液相色谱仪KQ-500E型超声波清洗仪Southern电泳仪美国BIO-RAD公司METTLERTOLEDO分析天平瑞士SHZ-Ⅲ循环水真空泵上海亚荣生化仪器厂RE-52型旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂干燥箱分子杂交仪水浴锅成像系统QuantStudio5荧光定量PCRNanodrop2000上海精宏上海乔枫上海一恒美国Synoptics公司赛默飞世尔科技赛默飞世尔科技（1）购置所有标准品均购自自赛默飞世尔科技尼龙膜购自BIOSHARP、DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKit（forcolordetectionwithNBT/BCIP）购自Roche。（2）试剂的配置①：称取的NaCl，用超纯水定容至200mL。②：称取4g的NaOH，用超纯水定容至200mL。③：用量筒量取的浓盐酸，用100mL超纯水稀释，待溶液冷却后，用超纯水定容至1L。④20×SSC：称取，柠檬酸钠.2H2O，800mL的水溶解，用浓HCL调PH至，定容至1L，高温高压灭菌20min备用。⑤马来酸缓冲液：称取马来酸，，先用900mL的超纯水溶解，在20℃用NaOH调pH至后，定容至1L，高温高压灭菌20min备用。⑥洗膜缓冲液：称取马来酸，，先用900mL的超纯水溶解，再加入3mLTween20，在20℃用NaOH调pH至后，定容至1L，高温高压灭菌20min备用。⑦检测缓冲液：称取，用900mL的超纯水溶解后，加入100mL1MTris-HCl（称取碱，加超纯水充分搅拌溶解，调至pH至，定容至100mL），在20℃调pH至后，定容至1L，高温高压灭菌20min备用。⑧TE缓冲液：称取，用900mL的超纯水溶解后，加入10mL1MTris-HCl，调pH至后，定容至1L，高温高压灭菌20min备用。⑨10%SDS：称取10gSDS，加入80mL超纯水溶解（68℃促溶），调至，定容至100mL，高温高压灭菌20min备用。分析转基因菌株中目的基因的整合情况（一）探针的标记1.以MD2基因组DNA为模板，扩增UnigeneA10182、A10251，经琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，测量回收产物浓度。2.取1μg回收产物,用ddH2O补足至16μL。100℃沸水浴10min使DNA变性后迅速插入冰水混合物中。3.根据DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKit（forcolordetectionwithNBT/BCIP）的操作方法进行后续实验。4.加4μLDIG高效引物到已变性的DNA中，短暂离心后加入2μL预染Marker,37℃标记4h.。℃作用10min终止标记反应。-20℃保存备用。（二）基因组DNA的提取提取MD2、MD2转化子的基因组DNA，方法同2.4.1“改良SDS-CTAB”法。提取完成后加入RNaseA37℃作用1h后加入苯酚/氯仿（1:1，V/V）抽提一次，以去除RNA的干扰。（三）基因组DNA的限制酶切用构建表达载体时所设计的目的基因两端的酶和表达框两端的酶对枝霉MD2（阴性对照）、过表达载体质粒（阳性对照）、MD2转化子基因组DNA进行酶切。酶切体系如下：表酶切体系TableThesystemofrestrictionenzymereaction组分体积基因组DNA/表达框质粒FDbuffer酶Ⅰ酶ⅡddH2O20μg3μL5μL5μLto30μL12000rpm离心，保证反应体系的精确，37℃酶切16h;65℃水浴10min，终止酶切反应。（四）DNA片段电泳分离采用0.8%的琼脂糖凝胶，先用200V电压电泳10min，再调节电压至30V电泳16h。电泳结束后，小心取出胶，切左上方小角做标记。（五）转膜1.脱嘌呤处理：当目的片段大于...
