第1页共5页编号:时间:2021年x月x日书山有路勤为径,学海无涯苦作舟页码:第1页共5页我公司相关资料龙葵总碱作用机理之最新研究——基质金属蛋白酶肿瘤,尤其是恶性肿瘤,是引起人类死亡的主要疾病之一。在原发灶的远处组织形成转移灶的能力(即转移的能力)是高度恶性肿瘤的一个重要特征,而肿瘤的转移性也是癌症引起死亡的主要原因。对于绝大多数原发灶肿瘤细胞来说,其中只有一小部分具有转移能力。这些具有高度转移能力的细胞具有以下几种特性:脱离原发肿瘤组织,向淋巴管或血管中迁移,穿过血管基底膜,穿透血管腔,逃脱免疫监视,与远离原发灶器官的血管内皮细胞粘附,离开血管(extravation),在被侵入的微环境中存活和生长。现在的观点认为基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMP)在肿瘤侵袭和转移过程中起重要作用。MMP在肿瘤侵袭转移中的作用曾一度被认为只是破坏基底膜及ECM中的其他部分。现已确认MMP在肿瘤演进的多个阶段均有作用,它影响肿瘤的起始、生长、血管生成、进入血管/离开血管和转移。因此,研究抗肿瘤药物对MMPs的影响,对研究药物的抗肿瘤转移方面具有重要意义[1].关于龙葵中生物碱对肿瘤细胞MMPs的影响,尚未见报道。本次实验,我们建立小鼠Lewis肺癌移植瘤模型,观察龙葵总碱对MMP-9基因mRNA表达的影响,初步探讨其抗肿瘤转移的作用机理。(一)实验材料:1、药材与试剂:龙葵总碱,6mg/瓶,由吉林市卓怡康纳制药有限公司提供,批号:20050602;A549、LLC肿瘤株,由南京中医药大学惠赠;注射用环磷酰胺(CTX),江苏恒瑞医药股份有限公司,批号:06011921;生理盐水,南京小营制药厂,批号:2005052505;第2页共5页第1页共5页编号:时间:2021年x月x日书山有路勤为径,学海无涯苦作舟页码:第2页共5页戊巴比妥钠,中国医药(集团)上海化学试剂公司(进口分装),批号:F20020405.2、实验动物:C57BL/6J小鼠,♀,6-8周龄,由南京大学模式动物中心提供,生产许可证:2005-0002.3、实验仪器:GS-15R台式冷冻离心机(Beckman);DK-8D电热恒温水浴槽(上海精宏实验设备有限公司);CO2培养箱(Formascientific);Pureplus纯水器(U.S.A);SW-CJ-1FD净化工作台(苏净集团安泰公司);Leica-DMIL型倒置显微镜(Leica);MP12001电子天平,上海市恒平科学仪器有限公司;AR2140型电子分析天平,奥赛斯国际贸易(上海)有限公司。4、实验条件:给药前后,小鼠分笼饲养,用全价颗粒饲料(由江宁青龙山动物繁殖场提供)喂养;温度20-25℃,湿度40-60%。5、统计方法:本实验量反应资料采用方差分析,统计软件用SPSS13.0。IC50计算LOGIT法。(二)实验方法:取接种Lewis肺癌14天的C57BL/6J荷瘤小鼠,脱颈椎处死,无菌条件下取瘤组织,按肿瘤质量(g)与生理盐水(ml)1:3制备匀浆液,500转/分钟离心5分钟,弃上清,用生理盐水调整细胞数1×106/ml备用,取C57BL/6J小鼠40只,分别于右腋皮下接种匀浆液,每只0.2ml(细胞数2×105)。接种后每日观察小鼠,等小鼠肿瘤长出,体积约为1cm3时,按肿瘤体积将上述小鼠随机分为5组:生理盐水(saline)组、龙第3页共5页第2页共5页编号:时间:2021年x月x日书山有路勤为径,学海无涯苦作舟页码:第3页共5页葵总碱(SNSA)低、中、高剂量组和环磷酰胺(CTX)组。分组后每组给予相应药物。龙葵总碱低、中、高剂量组剂量分别为2、4、8mg/kg,腹腔注射,连续给药5天。环磷酰胺60mg/kg,每隔7天给药一次。生理盐水组注射同体积生理盐水。第14口脱颈椎处死各组小鼠,取皮下瘤块,迅速放入液氮中保存,待测MMP-9基因mRNA表达[2-4]。用RT-PCR法检测Lewis肺癌组织MMP-9基因表达。检测方法如下:(1)耗材处理:0.1%DEPC水浸泡组织匀浆管、1.5ml离心管、0.6ml离心管、1000μl、100μl、10μl枪头等过夜。弃DEPC水,高压蒸汽灭菌组织匀浆管、1.5ml离心管、0.6ml离心管、1000μl、100μl、10μl枪头等。主要试剂:RNAiso为TAKARA产品,RT-PCR试剂盒为PROMEGA产品,dNTPs、MgCl2、rTaqPCR聚合酶、PCRDL2000Marker为TAKARA产品,其余试剂为进口分装。(2)大鼠组织提取总RNA及纯度鉴定:①取材:每组分别随机6各组织(模1、2、4、5、...