钠钙交换体基因稳定转染及药物筛选细胞模型的建立VIP免费

第1页共9页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第1页共9页史上最快最全的网络文档批量下载批量上传，尽在：http://item.taobao.com/item.htm?id=9176907081钠钙交换体基因稳定转染及药物筛选细胞模型的建立龙雁，袁辉，王晓良*中国医学科学院&北京协和医学院药物研究所先农坛街1号，北京，100050摘要：目的构建三种不同亚型的CHO-NCX稳定转染细胞株，以便筛选可能的钠钙交换体（NCX）调节剂。方法采用脂质体法将NCX目的基因稳定导入CHO细胞中，检测稳定转染细胞株中NCX的蛋白表达和电流大小，并观察温度和NCX抑制剂KB-R7943对电流的影响。结果Westernblot结果显示与CHO-pcDNA3.1空白细胞相比，CHO-NCX稳定转染细胞株中NCX蛋白的表达量显著升高；电生理结果提示CHO-NCX稳定转染细胞株中NCX电流远大于CHO-pcDNA3.1空白细胞；温度从22℃升高到35℃时，NCX电流显著增大；NCX抑制剂KB-R7943对INCX具有显著抑制作用。结论本试验成功的建立了特异性表达NCX1.1，NCX1.4，NCX1.5三种亚型的细胞模型，为脑缺血等疾病的研究提供了良好的药物筛选平台。关键词：NCX1.1；NCX1.4；NCX1.5；NCX抑制剂KB-R7943；膜片钳EstablishmentandEvalutionofCellModelTargetedatSodium-CalciumExchangerLongYan,YuanHui,WangXiaoliang(InstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)ABSTRAT:OBJECTIVETodeveloppotentialNCXmodulatorwith3differentkindsofCHO-NCXcellswhichstablyexpressedNCXproteins.METHODSTheNCXgeneswereligatedwithpcDNA3.1+vectorandthenstablyintroducedintoCHOcellsbyliposome.UsingwesternblotandpatchclamptechniquetomeasuretheexpressionlevelsofNCXproteinsandNCXcurrents,afterwhichtoobservethemagnitudeofNCXcurrentswhentemperaturechangedandNCXinhibitorutilized.RESULTSComparedwithblankCHO-pcDNA3.1cells,theproteinamountsofstablytransfectedCHO-NCXcellsweresignificantlyincreased;thecurrentsofCHO-NCXcellsweremuchhigherthanthatofblankCHO-pcDNA3.1cells.Whentemperaturechangedfrom22to35,thecurrentsofCHO-NCXcellsup-℃℃regulatednotably,afterNCXinhibitorKB-R7943added,thecurrentsofCHO-NCX第2页共9页第1页共9页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第2页共9页cellsdecreasedsignificantly.CONCLUSIONOurstudysuccessfullyconstructedacellmodelwhichexpressedaspecifickindofNCXisoforminCHOcells,whichprovidedausefultooltosearchnewdrugsofcerebralischemiatargetedatNCX.KEYWORDS:NCX1.1;NCX1.4;NCX1.5;NCXinhibitorKB-R7943;patchclamp作者简介：龙雁，女，博士研究生Tel：(010)63165193longyan@imm.ac.cn钠钙交换体（NCX）是细胞膜上具有9个跨膜片段的一种双向转运体，根据细胞膜内外离子浓度梯度和膜电位的不同，NCX可以通过正向转运（Ca2+外流）或者反向转运（Ca2+内流）两种转运方式将Na+和Ca2+以3：1或者4：1的比例进行交换，从而维持细胞内Ca2+的稳定[1-3]。生理状态下，NCX主要利用细胞内外的Na+浓度梯度排出细胞中的Ca2+[4]，而在病理状态下，当细胞内Na+浓度升高时，NCX反向转运可以导致细胞内钙超载。近年来越来越多的研究表明NCX与脑缺血关系非常密切，但结论并不一致。有的研究者认为抑制NCX反向转运具有脑保护作用，而有的研究者却认为激活NCX的反向转运可以有效保护神经元[5]。此外，在低氧缺氧，脊髓损伤后的白质退行性病变，大脑损伤，视神经损伤，神经元调亡，衰老和阿尔兹海默病等相关疾病中，也有研究提示NCX可能发挥了重要的作用[6]。由于NCX具有重要的生理和病理学意义，自1968年Baker等人首次报道NCX的存在以来，一直是人们研究的热点。内容包括NCX的分布表达，活性调节，结构-功能关系以及在疾病过程中的作用等方面，研究手段包括RNA/蛋白水平定位，反义寡核苷酸/RNAi技术，制备基因敲除小鼠等。但研究结果发现反义寡核苷酸技术仅在体外可行，体内无效[7-9]，NCX1基因敲除小鼠在胚胎状态则已死亡[10]...